umu.sePublikationer
Ändra sökning
RefereraExporteraLänk till posten
Permanent länk

Direktlänk
Referera
Referensformat
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Annat format
Fler format
Språk
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Annat språk
Fler språk
Utmatningsformat
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf
Identification of cellular protein targets for the Legionella pneumophila phosphocholinating effector AnkX
Umeå universitet, Teknisk-naturvetenskapliga fakulteten, Kemiska institutionen.
Visa övriga samt affilieringar
(Engelska)Manuskript (preprint) (Övrigt vetenskapligt)
Nationell ämneskategori
Biokemi och molekylärbiologi Mikrobiologi
Identifikatorer
URN: urn:nbn:se:umu:diva-140348OAI: oai:DiVA.org:umu-140348DiVA, id: diva2:1147438
Tillgänglig från: 2017-10-05 Skapad: 2017-10-05 Senast uppdaterad: 2018-06-09Bibliografiskt granskad
Ingår i avhandling
1. Selective protein functionalisation via enzymatic phosphocholination
Öppna denna publikation i ny flik eller fönster >>Selective protein functionalisation via enzymatic phosphocholination
2017 (Engelska)Doktorsavhandling, sammanläggning (Övrigt vetenskapligt)
Abstract [en]

Proteins are the most abundant biomolecules within a cell and are involved in all biochemical cellular processes ultimately determining cellular function. Therefore, to develop a complete understanding of cellular processes, obtaining knowledge about protein function and interaction at a molecular level is critical. Consequently, the investigation of proteins in their native environment or in partially purified mixtures is a major endeavour in modern life sciences. Due to their high chemical similarity, the inherent problem of studying proteins in complex mixtures is to specifically differentiate one protein of interest from the bulk of other proteins. Site-specific protein functionalisation strategies have become an indispensable tool in biochemical- and cell biology studies. This thesis presents the development of a new enzymatic site-specific protein functionalisation strategy that is based on the reversible covalent phosphocholination of short amino acid sequences in intact proteins. A synthetic strategy has been established that allows access to functionalised CDP-choline derivatives carrying fluorescent reporter groups, affinity tags or bioorthogonal handles. These CDP-choline derivatives serve as co-substrates for the bacterial phosphocholinating enzyme AnkX from Legionella pneumophila, which transfers a phosphocholine moiety to the switch II region of its native target protein Rab1b during infection. We identified the octapeptide sequence TITSSYYR as the minimum recognition sequence required to direct the AnkX catalysed phosphocholination and demonstrated the functionalisation of proteins of interest carrying this recognition tag at the N- or C-terminus as well as in internal loop regions. Moreover, this covalent modification can be hydrolytically reversed by the action of the Legionella enzyme Lem3, which makes the labeling strategy the first example of a covalent and reversible approach that is fully orthogonal to current existing methodologies. Thus, the here presented protein functionalisation approach holds the potential to increase the scope of possible labeling strategies in complex biological systems. In addition to the labeling of tagged target proteins, a CDP-choline derivative equipped with a biotin affinity-tag was synthesised and used in pull-down experiments to investigate the substrate scope of AnkX and to elucidate the role of protein phosphocholination during Legionella pneumophila infection.

Abstract [sv]

Proteiner utgör huvudbeståndsdelen av alla biomolekyler i en cell. Dessa är involverade i alla cellulära processer som bestämmer cellens egenskaper. För att förstå de cellulära processerna är det nödvändigt att förstå proteinernas funktion på molekylär nivå. Att studera proteiner i deras naturliga omgivning, det vill säga inuti en cell eller i ett cellextrakt, är en stor utmaning i dagens livsvetenskaper. Eftersom proteiner är kemiskt lika varandra så är det svårt att skilja ett från tusentals andra. Att specifikt märka proteiner för att skilja ut dem från bakgrunden har blivit ett viktigt arbetssätt i modern biokemi och cellbiologi. Avhandlingen beskriver utvecklandet av en ny metod för reversibel och kovalent enzymatisk märkning baserat på fosfokolinering/defosfokolinering av en kort aminosyrasekvens i intakta proteiner. En syntesmetod för att framställa onaturliga CDP-kolinderivat har etablerats vilket tillåter oss att framställa CDP-kolin som bär en funktionalitet, vilket kan vara ett färgämne eller en affinitetstagg. Dessa onaturliga CDP-kolinderivat accepteras som co-substrat av enzymet AnkX från Legionella pneumophila vilket transfererar den funktionaliserade delen av CDP-kolinderivatet till en kort aminosyrasekvens baserad på AnkX’s naturliga substrat vid infektion, det lilla GTPaset Rab1. Under avhandlingsarbetets gång identifierades den kortaste aminosyrasekvensen som känns igen av AnkX, endast de åtta aminosyrorna TITSSYYR är nödvändiga för igenkänning av AnkX. Dessa åtta aminosyror kan genetiskt infogas i början, slutet eller mitt i ett protein för igenkänning och funktionalisering via AnkX och våra syntetiska CDP-kolinderivat. Vid Legionellainfektion i eukaryota celler klyvs fosfokolineringen efter en viss tid, eftersom Legionella pneumophila producerar ett fosfodiesteras, Lem3, som tar bort de fosfokolineringar som AnkX har installerat när de inte längre behövs. Vi har använt Lem3 för att ta bort märkning i sekvensen TITSS(PC)YYR, vilket gör vår strategi helt reversibel. Vi har kunnat demonstrera att AnkX-Lem3 systemet accepterar ett brett spektrum av CDP-kolinderivat, vilket gör metoden till den första av sitt slag, eftersom den är fullt reversibel. Vi har vidare undersökt vilka proteiner AnkX reagerar med inuti celler, vi använde oss av ett CDP-kolinderivat funktionaliserat med biotin, vilket har tillåtit oss att fiska ut alla de proteiner som fosfokolineras av AnkX. Förutom de små GTPaserna i Rab-familjen så identifierade vi även IMPDH2, ett enzym som reglerar det hastighetsbestämmande steget i syntesen av guanosin-nukleotider. Detta är mycket intressant, eftersom det leder till frågan ifall Legionella pneumophila manipulerar sin värdcell genom att förändra mängden GTP i förhållande till ATP.

Ort, förlag, år, upplaga, sidor
Umeå: Umeå universitet, 2017. s. 101
Nyckelord
chemical biology, organic synthesis, site-selective protein labeling, PTM, phosphocholination, nucleotides, bioorthogonal chemistry, proteomics, IMPDH2
Nationell ämneskategori
Organisk kemi Biokemi och molekylärbiologi
Identifikatorer
urn:nbn:se:umu:diva-140349 (URN)978-91-7601-785-2 (ISBN)
Disputation
2017-11-03, KB.E3.01 (Lilla Hörsalen), Kemiska Institutionen, Umeå Universitet, KBC-huset, Umeå, 10:00 (Engelska)
Opponent
Handledare
Tillgänglig från: 2017-10-13 Skapad: 2017-10-05 Senast uppdaterad: 2018-06-09Bibliografiskt granskad

Open Access i DiVA

Fulltext saknas i DiVA

Personposter BETA

Ochtrop, PhilippHedberg, Christian

Sök vidare i DiVA

Av författaren/redaktören
Ochtrop, PhilippHedberg, Christian
Av organisationen
Kemiska institutionen
Biokemi och molekylärbiologiMikrobiologi

Sök vidare utanför DiVA

GoogleGoogle Scholar

urn-nbn

Altmetricpoäng

urn-nbn
Totalt: 246 träffar
RefereraExporteraLänk till posten
Permanent länk

Direktlänk
Referera
Referensformat
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Annat format
Fler format
Språk
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Annat språk
Fler språk
Utmatningsformat
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf