umu.sePublikationer
Ändra sökning
RefereraExporteraLänk till posten
Permanent länk

Direktlänk
Referera
Referensformat
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Annat format
Fler format
Språk
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Annat språk
Fler språk
Utmatningsformat
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf
Covalent Protein Labeling by Enzymatic Phosphocholination
Center for Integrated Protein Science Munich, Technische Universität München, Department Chemistry, Lichtenbergstrasse 4, 85748 Garching, Germany.
Umeå universitet, Teknisk-naturvetenskapliga fakulteten, Kemiska institutionen.
Umeå universitet, Teknisk-naturvetenskapliga fakulteten, Kemiska institutionen.
Center for Integrated Protein Science Munich, Technische Universität München, Department Chemistry, Lichtenbergstrasse 4, 85748 Garching, Germany.
Visa övriga samt affilieringar
2015 (Engelska)Ingår i: Angewandte Chemie International Edition, ISSN 1433-7851, E-ISSN 1521-3773, Vol. 54, nr 35, s. 10327-10330Artikel i tidskrift (Refereegranskat) Published
Abstract [en]

We present a new protein labeling method based on the covalent enzymatic phosphocholination of a specific octapeptide amino acid sequence in intact proteins. The bacterial enzyme AnkX from Legionella pneumophila has been established to transfer functional phosphocholine moieties from synthetically produced CDP-choline derivatives to N-termini, C-termini, and internal loop regions in proteins of interest. Furthermore, the covalent modification can be hydrolytically removed by the action of the Legionella enzyme Lem3. Only a short peptide sequence (eight amino acids) is required for efficient protein labeling and a small linker group (PEG-phosphocholine) is introduced to attach the conjugated cargo.

Ort, förlag, år, upplaga, sidor
2015. Vol. 54, nr 35, s. 10327-10330
Nyckelord [en]
enzymes, nucleotides, phosphocholination, protein modifications
Nationell ämneskategori
Biokemi och molekylärbiologi
Identifikatorer
URN: urn:nbn:se:umu:diva-109454DOI: 10.1002/anie.201502618ISI: 000360216800050PubMedID: 26147231OAI: oai:DiVA.org:umu-109454DiVA, id: diva2:859709
Forskningsfinansiär
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)Knut och Alice Wallenbergs StiftelseMax Planck GesellschaftTillgänglig från: 2015-10-08 Skapad: 2015-09-28 Senast uppdaterad: 2018-06-07Bibliografiskt granskad
Ingår i avhandling
1. Synthesis and investigation of bacterial effector molecules
Öppna denna publikation i ny flik eller fönster >>Synthesis and investigation of bacterial effector molecules
2016 (Engelska)Doktorsavhandling, sammanläggning (Övrigt vetenskapligt)
Abstract [en]

During infections, bacterial microorganisms initiate profound interactions with mammalian host cells. Usually defense mechanisms of the host destroy intruding bacteria in rapid manner. However, many bacterial pathogens have evolved in a way to avoid these mechanisms. By use of effector molecules, which can be small organic molecules or proteins with enzymatic activity, the host is manipulated on a molecular level. Effectors mediating post-translational modifications (PTMs) are employed by many pathogens to influence the biological activity of host proteins. In the presented thesis, two related PTMs are investigated in detail: Adenylylation, the covalent transfer of an adenosine monophosphate group from adenosine triphosphate onto proteins, and phosphocholination, the covalent transfer of a phosphocholine moiety onto proteins. Over the past years, enzymes mediating these modifications have been discovered in several pathogens, especially as a mechanism to influence the signaling of eukaryotic cells by adenylylating or phosphocholinating small GTPases. However, the development of reliable methods for the isolation and identification of adenylylated and phosphocholinated proteins remains a vehement challenge in this field of research. This thesis presents general procedures for the synthesis of peptides carrying adenylylated or phosphocholinated tyrosine, threonine and serine residues. From the resulting peptides, mono-selective polyclonal antibodies against adenylylated tyrosine and threonine have been raised. The antibodies were used as tools for proteomic research to isolate unknown substrates of adenylyl transferases from eukaryotic cells. Mass spectrometric fragmentation techniques have been investigated to ease the identification of adenylylated proteins. Furthermore, this work presents a new strategy to identify adenylylated proteins. Additionally, small effector molecules are involved in the regulation of infection mechanisms. In this work, the small molecule LAI-1 (Legionella autoinducer 1) from the pathogen Legionella pneumophila, the causative agent of the Legionnaire’s disease, was synthesised together with its amino-derivatives. LAI-1 showed are a clear pharmacological effect on the regulation of the life cycle of L. pneumophila, initiating transmissive traits like motility and virulence. Furthermore, LAI-1 was shown to have an effect on eukaryotic cells as well. Directed motility of the eukaryotic cells was significantly reduced and the cytoskeletal architecture was reorganised, probably by interfering with the small GTPase Cdc42.

Ort, förlag, år, upplaga, sidor
Umeå: Umeå University, 2016. s. 110
Nyckelord
bacterial effectors, organic synthesis, Legionella, PTM, peptide synthesis, nucleotide chemistry
Nationell ämneskategori
Organisk kemi
Forskningsämne
bioorganisk kemi
Identifikatorer
urn:nbn:se:umu:diva-114698 (URN)978-91-7601-411-0 (ISBN)
Disputation
2016-02-19, KB3A9, KBC-huset, Umeå University, Umeå, 10:00 (Engelska)
Opponent
Handledare
Tillgänglig från: 2016-01-29 Skapad: 2016-01-26 Senast uppdaterad: 2018-06-07Bibliografiskt granskad
2. Selective protein functionalisation via enzymatic phosphocholination
Öppna denna publikation i ny flik eller fönster >>Selective protein functionalisation via enzymatic phosphocholination
2017 (Engelska)Doktorsavhandling, sammanläggning (Övrigt vetenskapligt)
Abstract [en]

Proteins are the most abundant biomolecules within a cell and are involved in all biochemical cellular processes ultimately determining cellular function. Therefore, to develop a complete understanding of cellular processes, obtaining knowledge about protein function and interaction at a molecular level is critical. Consequently, the investigation of proteins in their native environment or in partially purified mixtures is a major endeavour in modern life sciences. Due to their high chemical similarity, the inherent problem of studying proteins in complex mixtures is to specifically differentiate one protein of interest from the bulk of other proteins. Site-specific protein functionalisation strategies have become an indispensable tool in biochemical- and cell biology studies. This thesis presents the development of a new enzymatic site-specific protein functionalisation strategy that is based on the reversible covalent phosphocholination of short amino acid sequences in intact proteins. A synthetic strategy has been established that allows access to functionalised CDP-choline derivatives carrying fluorescent reporter groups, affinity tags or bioorthogonal handles. These CDP-choline derivatives serve as co-substrates for the bacterial phosphocholinating enzyme AnkX from Legionella pneumophila, which transfers a phosphocholine moiety to the switch II region of its native target protein Rab1b during infection. We identified the octapeptide sequence TITSSYYR as the minimum recognition sequence required to direct the AnkX catalysed phosphocholination and demonstrated the functionalisation of proteins of interest carrying this recognition tag at the N- or C-terminus as well as in internal loop regions. Moreover, this covalent modification can be hydrolytically reversed by the action of the Legionella enzyme Lem3, which makes the labeling strategy the first example of a covalent and reversible approach that is fully orthogonal to current existing methodologies. Thus, the here presented protein functionalisation approach holds the potential to increase the scope of possible labeling strategies in complex biological systems. In addition to the labeling of tagged target proteins, a CDP-choline derivative equipped with a biotin affinity-tag was synthesised and used in pull-down experiments to investigate the substrate scope of AnkX and to elucidate the role of protein phosphocholination during Legionella pneumophila infection.

Abstract [sv]

Proteiner utgör huvudbeståndsdelen av alla biomolekyler i en cell. Dessa är involverade i alla cellulära processer som bestämmer cellens egenskaper. För att förstå de cellulära processerna är det nödvändigt att förstå proteinernas funktion på molekylär nivå. Att studera proteiner i deras naturliga omgivning, det vill säga inuti en cell eller i ett cellextrakt, är en stor utmaning i dagens livsvetenskaper. Eftersom proteiner är kemiskt lika varandra så är det svårt att skilja ett från tusentals andra. Att specifikt märka proteiner för att skilja ut dem från bakgrunden har blivit ett viktigt arbetssätt i modern biokemi och cellbiologi. Avhandlingen beskriver utvecklandet av en ny metod för reversibel och kovalent enzymatisk märkning baserat på fosfokolinering/defosfokolinering av en kort aminosyrasekvens i intakta proteiner. En syntesmetod för att framställa onaturliga CDP-kolinderivat har etablerats vilket tillåter oss att framställa CDP-kolin som bär en funktionalitet, vilket kan vara ett färgämne eller en affinitetstagg. Dessa onaturliga CDP-kolinderivat accepteras som co-substrat av enzymet AnkX från Legionella pneumophila vilket transfererar den funktionaliserade delen av CDP-kolinderivatet till en kort aminosyrasekvens baserad på AnkX’s naturliga substrat vid infektion, det lilla GTPaset Rab1. Under avhandlingsarbetets gång identifierades den kortaste aminosyrasekvensen som känns igen av AnkX, endast de åtta aminosyrorna TITSSYYR är nödvändiga för igenkänning av AnkX. Dessa åtta aminosyror kan genetiskt infogas i början, slutet eller mitt i ett protein för igenkänning och funktionalisering via AnkX och våra syntetiska CDP-kolinderivat. Vid Legionellainfektion i eukaryota celler klyvs fosfokolineringen efter en viss tid, eftersom Legionella pneumophila producerar ett fosfodiesteras, Lem3, som tar bort de fosfokolineringar som AnkX har installerat när de inte längre behövs. Vi har använt Lem3 för att ta bort märkning i sekvensen TITSS(PC)YYR, vilket gör vår strategi helt reversibel. Vi har kunnat demonstrera att AnkX-Lem3 systemet accepterar ett brett spektrum av CDP-kolinderivat, vilket gör metoden till den första av sitt slag, eftersom den är fullt reversibel. Vi har vidare undersökt vilka proteiner AnkX reagerar med inuti celler, vi använde oss av ett CDP-kolinderivat funktionaliserat med biotin, vilket har tillåtit oss att fiska ut alla de proteiner som fosfokolineras av AnkX. Förutom de små GTPaserna i Rab-familjen så identifierade vi även IMPDH2, ett enzym som reglerar det hastighetsbestämmande steget i syntesen av guanosin-nukleotider. Detta är mycket intressant, eftersom det leder till frågan ifall Legionella pneumophila manipulerar sin värdcell genom att förändra mängden GTP i förhållande till ATP.

Ort, förlag, år, upplaga, sidor
Umeå: Umeå universitet, 2017. s. 101
Nyckelord
chemical biology, organic synthesis, site-selective protein labeling, PTM, phosphocholination, nucleotides, bioorthogonal chemistry, proteomics, IMPDH2
Nationell ämneskategori
Organisk kemi Biokemi och molekylärbiologi
Identifikatorer
urn:nbn:se:umu:diva-140349 (URN)978-91-7601-785-2 (ISBN)
Disputation
2017-11-03, KB.E3.01 (Lilla Hörsalen), Kemiska Institutionen, Umeå Universitet, KBC-huset, Umeå, 10:00 (Engelska)
Opponent
Handledare
Tillgänglig från: 2017-10-13 Skapad: 2017-10-05 Senast uppdaterad: 2018-06-09Bibliografiskt granskad

Open Access i DiVA

Fulltext saknas i DiVA

Övriga länkar

Förlagets fulltextPubMed

Personposter BETA

Ochtrop, PhilippAlbers, Michael F.Hedberg, Christian

Sök vidare i DiVA

Av författaren/redaktören
Ochtrop, PhilippAlbers, Michael F.Hedberg, Christian
Av organisationen
Kemiska institutionen
I samma tidskrift
Angewandte Chemie International Edition
Biokemi och molekylärbiologi

Sök vidare utanför DiVA

GoogleGoogle Scholar

doi
pubmed
urn-nbn

Altmetricpoäng

doi
pubmed
urn-nbn
Totalt: 731 träffar
RefereraExporteraLänk till posten
Permanent länk

Direktlänk
Referera
Referensformat
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Annat format
Fler format
Språk
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Annat språk
Fler språk
Utmatningsformat
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf