umu.sePublications
Change search
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf
Enhanced protein misfolding in patient-derived models of amyotrophic lateral sclerosis
Umeå University, Faculty of Medicine, Department of Pharmacology and Clinical Neuroscience.
Umeå University, Faculty of Medicine, Department of Pharmacology and Clinical Neuroscience.
Umeå University, Faculty of Medicine, Department of Pharmacology and Clinical Neuroscience.
Show others and affiliations
(English)Manuscript (preprint) (Other (popular science, discussion, etc.))
National Category
Natural Sciences
Identifiers
URN: urn:nbn:se:umu:diva-138943OAI: oai:DiVA.org:umu-138943DiVA, id: diva2:1138243
Available from: 2017-09-04 Created: 2017-09-04 Last updated: 2019-03-06
In thesis
1. Using patient-derived cell models to investigate the role of misfolded SOD1 in ALS
Open this publication in new window or tab >>Using patient-derived cell models to investigate the role of misfolded SOD1 in ALS
2017 (English)Doctoral thesis, comprehensive summary (Other academic)
Alternative title[sv]
Patient-deriverade stamceller som modellsystem för att studera felveckat SOD1 i ALS
Abstract [en]

Protein misfolding and aggregation underlie several neurodegenerative proteinopathies including amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Superoxide dismutase 1 (SOD1) was the first gene found to be associated with familial ALS. Overexpression of human mutant or wild type SOD1 in transgenic mouse models induces motor neuron (MN) degeneration and an ALS-like phenotype. SOD1 mutations, leading to the destabilization of the SOD1 protein is associated with ALS pathogenesis. However, how misfolded SOD1 toxicity specifically affects human MNs is not clear. The aim of this thesis was to develop patient-derived, cellular models of ALS to help understand the pathogenic mechanisms underlying SOD1.

To understand which cellular pathways impact on the level of misfolded SOD1 in human cells, we established a model using patient-derived fibroblasts and quantified misfolded SOD1 in relation to disturbances in several ALS-related cellular pathways. Misfolded SOD1 levels did not change following reduction in autophagy, inhibition of the mitochondrial respiratory chain, or induction of endoplasmic reticulum (ER)-stress. However, inhibition of the ubiquitin-proteasome system (UPS) lead to a dramatic increase in misfolded SOD1 levels. Hence, an age-related decline in proteasome activity might underlie the late-life onset that is typically seen in SOD1 ALS.

To address whether or not SOD1 misfolding is enhanced in human MNs, we used mixed MN/astrocyte cultures (MNCs) generated in vitro from patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs). Levels of soluble misfolded SOD1 were increased in MNCs as well as in pure iPSC-derived astrocytes compared to other cell types, including sensory neuron cultures. Interestingly, this was the case for both mutant and wild type human SOD1, although the increase was enhanced in SOD1 FALS MNCs. Misfolded SOD1 was also found to exist in the same form as in mouse SOD1 overexpression models and was identified as a substrate for 20S proteasome degradation. Hence, the vulnerability of motor areas to ALS could be explained by increased SOD1 misfolding, specifically in MNs and astrocytes.

To investigate factors that might promote SOD1 misfolding, we focussed on the stability of SOD1 mediated by a crucial, stabilizing C57-C146 disulphide bond and its redox status. Formation of disulphide bond is dependent on oxidation by O2 and catalysed by CCS. To investigate whether low O2 tension affects the stability of SOD1 in vitro we cultured fibroblasts and iPSC-derived MNCs under different oxygen tensions. Low oxygen tension promoted disulphide-reduction, SOD1 misfolding and aggregation. This response was much greater in MNCs compared to fibroblasts, suggesting that MNs may be especially sensitive to low oxygen tension and areas with low oxygen supply could serve as foci for ALS initiation.

SOD1 truncation mutations often lack C146, and cannot adopt a native fold and are rapidly degraded. We characterized soluble misfolded and aggregated SOD1 in patient-derived cells carrying a novel SOD1 D96Mfs*8 mutation as well as in cells fom an unaffected mutation carrier. The truncated protein has a C-terminal fusion of seven non-native amino acids and was found to be extremely prone to aggregation in vitro. Since not all mutation carriers develop ALS, our results suggested this novel mutation is associated with reduced penetrance.

In summary, patient derived cells are useful models to study factors affecting SOD1 misfolded and aggregation. We show for the first time that misfolding of a disordered and disease associated protein is enhanced in disease-related cell types. Showing that misfolded SOD1 exists in human cells in the same form as in transgenic mouse models strengthens the translatability of results obtained in the two species. Our results demonstrate disulphide-reduction and misfolding/aggregation of SOD1 and suggest that 20S proteasome could be an important therapeutic target for early stages of disease. This model provides a great opportunity to study pathogenic mechanisms of both familial and sporadic ALS in patient-derived models of ALS. 

Abstract [sv]

Varje år insjuknar omkring 5300 personer i världen i motorneuronsjukdomen Amyotrofisk lateralskleros (ALS). Sjukdomen kännetecknas av degeneration av motorneuron i hjärnan och ryggmärgen, de nervceller som styr kroppens muskler, vilket leder till musklerförtvining och gradvis förlamning. ALS-patienter avlider oftast till följd av andningssvikt när sjukdomen når andningsmuskulaturen. I de allra flesta fall uppkommer ALS sporadiskt (SALS), det vill säga utan känd genetisk orsak, medan ärftliga fall (FALS) drabbar omkring 10 % och beror på mutationer i ett antal kända gener. Upp till 6 % av alla ALS fall kan härledas till mutationer i genen superoxid dismutas 1 (SOD1).

SOD1 är ett enzym som ansvarar för att omvandla och oskadliggöra fria syreradikaler som bildas vid normal ämnesomsättning. 206 olika SOD1 mutationer har identifierats, alla orsakar inte ALS men många leder till att den tredimensionella proteinstrukturen förändras, vilket ökar proteinets benägenhet att felveckas. Initialt trodde man att SOD1 mutationer förhindrade proteinets normalfunktion och följaktligen orsakade ALS. Studier har emellertid visat att den enzymatiska funktionen ofta bevaras, även hos muterade proteiner. Däremot kan små mängder felveckat SOD1 störa andra viktiga cellulära funktioner. Felveckat SOD1 har en benägenhet att klumpa ihop sig och bilda aggregat i det centrala nervsystemet (CNS). Dessa aggregat återfinns hos patienter med såväl FALS som SALS vilket tyder på att även vildtyps-SOD1 kan felveckas och vara involverat i sjukdomsutvecklingen. De flesta studier är baserade på transgena musmodeller som uttrycker extremt stora mängder av muterat humant SOD1. Det är dock oklart hur väl studier i möss överensstämmer med sjukdomsutvecklingen hos ALS-patienter, där mängden SOD1 är betydligt lägre. En central fråga som fortfarande står obesvarad är varför just motorneuron degenererar i ALS, trots att SOD1 uttrycks i alla kroppens celler.

Det övergripande syftet med den här avhandlingen har varit att karakterisera felveckat SOD1 i patientceller för att studera dess roll i ALSrelaterade sjukdomsmekanismer med fysiologiskt relevanta nivåer av SOD1. Samtliga studier är gjorda in vitro med celler från friska donatorer med vildtyps-SOD1, celler från patienter med SOD1-FALS, FALS som bär andra ALS-associerade gener, samt SALS. I de allra flesta fallen har vi analyserat både lösligt felveckat SOD1 samt aggregerade former av SOD1 proteinet.

Place, publisher, year, edition, pages
Umeå: Umeå University, 2017. p. 95
Series
Umeå University medical dissertations, ISSN 0346-6612 ; 1913
Keywords
ALS, SOD1, patient-derived models, induced pluripotent stem cells, motor neurons, astrocytes, 20S proteasome low oxygen tension, misfolded SOD1
National Category
Natural Sciences
Research subject
Neurology
Identifiers
urn:nbn:se:umu:diva-138948 (URN)978-91-7601-759-3 (ISBN)
Public defence
2017-09-28, Major Groove, building 6L, Umeå, 09:00 (English)
Opponent
Supervisors
Available from: 2017-09-07 Created: 2017-09-04 Last updated: 2018-06-09Bibliographically approved
2. SOD1 misfolding and aggregation in ALS: in the light of conformation-specific antibodies
Open this publication in new window or tab >>SOD1 misfolding and aggregation in ALS: in the light of conformation-specific antibodies
2019 (English)Doctoral thesis, comprehensive summary (Other academic)
Alternative title[sv]
SOD1 felveckning och aggregering i ALS : i fokus för strukturspecifika antikroppar
Abstract [en]

Mutations in the superoxide dismutase 1 (SOD1) gene are linked to the progressive neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS). ALS-associated mutations affect the stability of the SOD1 protein and promote its unfolding. As a consequence, disordered SOD1 species can misfold and accumulate into insoluble aggregates. Cytoplasmic inclusions containing misfolded SOD1 are a hallmark of ALS pathology in patients as well as transgenic mouse models. However, it remains unclear, which SOD1 species are pathogenic and how they arise and contribute to the disease.

The aim of this thesis was to use antibodies as tools to study the role of disordered and aggregated SOD1 species in ALS. These antibodies recognize epitopes exposed in disordered SOD1 species and hence, discriminate between natively folded SOD1 and the disordered or misfolded protein.

SOD1 is expressed in all cell types, but aggregates of misfolded SOD1 are predominantly found in motor neurons and associated glial cells in the spinal cord of ALS patients. To understand why misfolded SOD1 targets the motor system, we used ELISA and immunocapture methods to quantify soluble SOD1 species in patient-derived cell models of ALS. The highest levels of soluble disordered SOD1 were detected in induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived motor neuron and astrocytes cultures (MNACs) compared to fibroblasts, iPSCs and sensory neuron cultures. These results suggest that the selective vulnerability of motor areas to SOD1-ALS could derive from an enhanced burden of disordered SOD1.

To understand factors that might promote SOD1 unfolding, we focussed on the disulfide bond that is required for the stability of natively folded SOD1. Formation of the bond is oxygen-dependent and reduction of the bond promotes SOD1 unfolding. We studied the stability of SOD1 in patient-derived cells exposed to lowered oxygen tensions. This induced increases in disulfide-reduced, disordered mutant and wild-type SOD1. The response was time- and concentration-dependent and more pronounced in MNACs, where even increased aggregation of mutant SOD1 was observed. These results are consistent with the enhanced vulnerability of the motor system in ALS and suggest that conditions causing impaired oxygen perfusion could contribute to the initiation and progression of the disease.

Inclusions containing aggregated misfolded wild-type SOD1 have been found in sporadic ALS (sALS) patients without SOD1 mutations and those carrying mutations in genes other than SOD1. However, other groups have reported contrasting results and the contribution of misfolded wild-type SOD1 to ALS pathology is controversial. Guidelines for preservation, storage, and analysis of tissues under standardized conditions would facilitate the comparison of results between different laboratories. We established an optimized immunohistochemistry protocol to detect misfolded wild-type SOD1 in paraffin-embedded spinal cord samples from sALS patients. We also developed a method to immunocapture disordered SOD1 from frozen post-mortem tissue. High, but variable, levels of disordered SOD1 were detected in spinal cords from sALS patients. Our data support a possible pathological role of misfolded wild-type SOD1 in sALS.

Recent evidence suggests that SOD1 aggregates can induce templated aggregation of disordered SOD1 and spread from cell-to-cell via a prion-like mechanism. To test if antibodies could block this process in vivo, we conducted an immunotherapy study in a model of prion-like spread, where SOD1 aggregate seeds are inoculated into the lumbar spinal cord of SOD1G85R transgenic mice and lead to accelerated disease onset and progression. Novel monoclonal antibodies (mAb) against disordered domains of SOD1 aggregates were developed and validated for their reactivity to disordered and aggregated SOD1 species in vitro and in vivo. Immunotherapy using a mAb against the C-terminal end of SOD1 attenuated the onset and progression of prion-like SOD1 spread. However, no effect was seen on onset, duration or progression of the underlying disease. This suggests that, under the conditions tested, immunotherapy against disordered domains of SOD1 does not affect intracellular aggregation and additional strategies might be needed to reduce intracellular accumulation of misfolded SOD1 aggregation.

In conclusion, we show that conformation-specific antibodies are powerful tools to investigate disordered and potentially pathogenic species of SOD1 in various biochemical, cellular and in vivo contexts. The development of the novel immunocapture strategy could facilitate future research on characterizing SOD1 aggregates from mouse tissues, patient-derived cells or post-mortem tissues with the goal of determining their role in ALS disease pathogenesis.

Abstract [sv]

Mutationer i superoxiddismutas 1 (SOD1) genen kan orsaka den progressiva neurodegenerativa sjukdomen Amyotrofisk lateralskleros (ALS). ALSassocierade mutationer påverkar stabiliteten hos SOD1-proteinet och gör att det förlorar sin naturliga struktur. Det ostrukturerade muterade proteinet kan sedan fel-veckas och aggregera. Ansamlingar av aggregerat SOD1 protein i drabbade motoriska nervceller är ett välkänt fenomen, både hos patienter samt i transgena musmodeller för SOD1-ALS. Syftet med denna avhandling var att utveckla och karaktärisera nya antikroppar och metoder för att studera hur, och varför dessa sjukdomsassocierade SOD1 aggregat bildas, ansamlas och sprider sig vid ALS. Vårt slutgiltiga mål var att identifiera en antikropp som kunde användas för immunterapibehandling för att bromsa sjukdomen

SOD1 protein uttrycks i kroppens alla celltyper. Varför är det då specifikt ryggmärgens, och hjärnans motoriska nervceller och de omkringliggande stödjecellerna (astrocyter) som påverkas vid ALS, och bara där som aggregat av felveckat SOD1 bildas? För att förstå varför muterat SOD1 är specifikt farligt för motorsystemet odlade vi celler från ALS patienter i vårt laboratorium, och använde biokemiska metoder för att mäta mängden lösligt ostrukturerat SOD1 protein i olika celltyper. De högsta nivåerna av lösligt ostrukturerat SOD1 detekterades i celler som omprogrammerats till pluripotenta stamceller (iPSC), och sedan differentierats ut till motoriska nervceller och astrocyter. Vi jämförde med fibroblaster, iPSCs och iPSCs deriverade sensoriska nervceller. Våra resultat tyder på att den selektiva sårbarheten hos motorsystemet vid SOD1-ALS skulle kunna härledas till en ökad ansamling av ostrukturerat SOD1 protein i motoriska nervceller och astrocyter.

Vilka mijöfaktorer skulle kunna bidra till att SOD1 tappar sin naturliga struktur och börjar bilda aggregat? Här fokuserade vi på en disulfidbrygga som stärker stabiliteten hos normal-veckat SOD1 protein. Disulfidbryggan är syreberoende och reduktion av denna leder till ökad sannolikhet att SOD1 proteinet tappar sin normala struktur, kan fel-veckas och bilda aggregat. Vi studerade hur låg syrehalt påverkade disulfidbryggan och mängden ostrukturerat SOD1 i celler från patienter. Låg syrenivå ledde till reducerad disulfidbindning, och ökad mängd ostrukturerat SOD1 protein. Både celler med ALS-länkade mutationer i SOD1, och med normalt vildtypsprotein, påverkades av lågt syre, och effekten var tid- och koncentrationsberoende. Motoriska nervceller och astrocyter påverkades mest, och i dessa celler ledde låg syrehalt även till aggregering av mutant SOD1. Dessa resultat bidrar till att förklara motorsystemets sårbarhet vid ALS, och föreslår att tillstånd som orsakar nedsatt syresättning i nervsystemet kan bidra till sjukdomsutveckling.

Flera studier har rapporterat att det även bildas aggregat av felveckat vildtypsSOD1 i vävnad från patienter med sporadisk ALS (sALS), och patienter med mutation i andra ALS-länkade gener, utan SOD1-mutationer. Andra studier har dock rapporterat motsatt resultat, så både förekomst och betydelse av aggregerat vildtyps-SOD1 är kontroversiellt.

Vi har sammanställt gemensamma riktlinjer för fixering, lagring och analysprotokoll som skulle kunna underlätta jämförelsen av resultat från olika laboratorier. Vi beskriver i detalj ett etablerat, optimerat immunohistokemiprotokoll för att färga aggregerat vildtyps-SOD1 i vävnadssnitt från från sALS-patienter. Vi har också utvecklat en antikroppsbaserad metod för att detektera sjukdomsassocierat SOD1 i homogeniserad frusen ryggmärgsvävnad. Höga, men varierande, nivåer av ostrukturerat och felveckat SOD1 detekterades i vävnad från sALS-patienter. Våra resultat stöder hypotesen att felveckat vildtyps-SOD1 kan bidra till sjukdomsutveckling hos ALS-patienter utan SOD1 mutation.

Med mål att utveckla immunterapi mot SOD1-ALS producerade, och karaktäriserade vi monoklonala antikroppar som specifikt binder sjukdomsassocierat SOD1 protein. Tidigare studier tyder på att SOD1 aggregat kan få ostrukturerat SOD1 protein att börja aggregera och spridas från cell till cell via en prion-liknande mekanism. Vi använde en musmodell för ALS, som bygger på att en liten mängd aggregerat SOD1 injiceras i ryggmärgen hos transgena möss och leder till prion-liknande spridning av SOD1 aggregat, och progressiv ALSliknande förlamning. Immunoterapibehandling med hjälp av en av våra monoklonala antikroppar som binder den C-terminala änden av SOD1 kunde binda SOD1 aggregat in vivo, dämpade SOD1-aggregatens aktivitet och förlängde mössens överlevnad. Immunterapi behandling kunde däremot inte hämma start, progression eller förlänga överlevnad hos transgena möss som uttrycker muterat humant SOD1 och utvecklar ALS-liknande förlamningssjukdom. Våra resultat tyder på att antikroppsbaserad behandling kan bromsa extracellulär spridning av SOD1 aggregat men har svårt att komma in i motoriska nervceller och förhindra intracellulär SOD1 aggregering.

Sammanfattningsvis visar vi att strukturspecifika antikroppar är kraftfulla verktyg för att undersöka ostrukturerat och patogena arter av SOD1 protein i olika biokemiska, cellulära och in vivo studier. Utvecklingen av nya antikroppar och metoder kan underlätta ny forskning om de cellulära mekanismer som påverkar bildningen av patogena arter av SOD1 aggregat och nervcells död vid ALS.

Place, publisher, year, edition, pages
Umeå: Umeå university, 2019. p. 71
Series
Umeå University medical dissertations, ISSN 0346-6612 ; 2021
Keywords
ALS, antibodies, SOD1, disordered SOD1, patient-derived models, low oxygen tension, Immunotherapy
National Category
Clinical Medicine Neurology
Identifiers
urn:nbn:se:umu:diva-157036 (URN)978-91-7855-032-6 (ISBN)
Public defence
2019-03-29, Betula, Norrlands universitetssjukhus, Building 6M, NUS, Umeå, 09:00 (English)
Opponent
Supervisors
Available from: 2019-03-08 Created: 2019-03-06 Last updated: 2019-03-22Bibliographically approved

Open Access in DiVA

No full text in DiVA

Authority records BETA

Forsgren, ElinLehmann, ManuelaKeskin, IsilZetterström, PerAndersen, PeterMarklund, StefanGilthorpe, Jonathan

Search in DiVA

By author/editor
Forsgren, ElinLehmann, ManuelaKeskin, IsilZetterström, PerAndersen, PeterMarklund, StefanGilthorpe, Jonathan
By organisation
Department of Pharmacology and Clinical NeuroscienceClinical chemistry
Natural Sciences

Search outside of DiVA

GoogleGoogle Scholar

urn-nbn

Altmetric score

urn-nbn
Total: 403 hits
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf