umu.sePublications
Change search
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf
The molecular pathogenesis of superoxide dismutase 1-linked ALS is promoted by low oxygen tension
Umeå University, Faculty of Medicine, Department of Medical Biosciences, Pathology.
Umeå University, Faculty of Medicine, Department of Pharmacology and Clinical Neuroscience, Clinical Neuroscience.
Umeå University, Faculty of Medicine, Department of Pharmacology and Clinical Neuroscience.
Umeå University, Faculty of Medicine, Department of Pharmacology and Clinical Neuroscience.
Show others and affiliations
2019 (English)In: Acta Neuropathologica, ISSN 0001-6322, E-ISSN 1432-0533, Vol. 138, no 1, p. 85-101Article in journal (Refereed) Published
Abstract [en]

Mutations in superoxide dismutase 1 (SOD1) cause amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Disease pathogenesis is linked to destabilization, disorder and aggregation of the SOD1 protein. However, the non-genetic factors that promote disorder and the subsequent aggregation of SOD1 have not been studied. Mainly located to the reducing cytosol, mature SOD1 contains an oxidized disulfide bond that is important for its stability. Since O2 is required for formation of the bond, we reasoned that low O2 tension might be a risk factor for the pathological changes associated with ALS development. By combining biochemical approaches in an extensive range of genetically distinct patient-derived cell lines, we show that the disulfide bond is an Achilles heel of the SOD1 protein. Culture of patient-derived fibroblasts, astrocytes, and induced pluripotent stem cell-derived mixed motor neuron and astrocyte cultures (MNACs) under low oxygen tensions caused reductive bond cleavage and increases in disordered SOD1. The effects were greatest in cells derived from patients carrying ALS-linked mutations in SOD1. However, significant increases also occurred in wild-type SOD1 in cultures derived from non-disease controls, and patients carrying mutations in other common ALS-linked genes. Compared to fibroblasts, MNACs showed far greater increases in SOD1 disorder and even aggregation of mutant SOD1s, in line with the vulnerability of the motor system to SOD1-mediated neurotoxicity. Our results show for the first time that O2 tension is a principal determinant of SOD1 stability in human patient-derived cells. Furthermore, we provide a mechanism by which non-genetic risk factors for ALS, such as aging and other conditions causing reduced vascular perfusion, could promote disease initiation and progression.

Place, publisher, year, edition, pages
New York: Springer, 2019. Vol. 138, no 1, p. 85-101
Keywords [en]
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Superoxide dismutase 1 (SOD1), Disulfide bond, Oxygen tension, Protein disorder, Protein aggregation, Patient-derived cells
National Category
Biochemistry and Molecular Biology
Identifiers
URN: urn:nbn:se:umu:diva-157037DOI: 10.1007/s00401-019-01986-1ISI: 000471708700005PubMedID: 30863976OAI: oai:DiVA.org:umu-157037DiVA, id: diva2:1294121
Funder
Swedish Research Council, VRMH 2015-02804Knut and Alice Wallenberg Foundation, 2012.0091Västerbotten County CouncilThe Kempe FoundationsThe Swedish Brain Foundation, Hjarnfonden FO2015-0234
Note

Originally included in thesis in manuscript form.

Available from: 2019-03-06 Created: 2019-03-06 Last updated: 2019-07-12Bibliographically approved
In thesis
1. SOD1 misfolding and aggregation in ALS: in the light of conformation-specific antibodies
Open this publication in new window or tab >>SOD1 misfolding and aggregation in ALS: in the light of conformation-specific antibodies
2019 (English)Doctoral thesis, comprehensive summary (Other academic)
Alternative title[sv]
SOD1 felveckning och aggregering i ALS : i fokus för strukturspecifika antikroppar
Abstract [en]

Mutations in the superoxide dismutase 1 (SOD1) gene are linked to the progressive neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS). ALS-associated mutations affect the stability of the SOD1 protein and promote its unfolding. As a consequence, disordered SOD1 species can misfold and accumulate into insoluble aggregates. Cytoplasmic inclusions containing misfolded SOD1 are a hallmark of ALS pathology in patients as well as transgenic mouse models. However, it remains unclear, which SOD1 species are pathogenic and how they arise and contribute to the disease.

The aim of this thesis was to use antibodies as tools to study the role of disordered and aggregated SOD1 species in ALS. These antibodies recognize epitopes exposed in disordered SOD1 species and hence, discriminate between natively folded SOD1 and the disordered or misfolded protein.

SOD1 is expressed in all cell types, but aggregates of misfolded SOD1 are predominantly found in motor neurons and associated glial cells in the spinal cord of ALS patients. To understand why misfolded SOD1 targets the motor system, we used ELISA and immunocapture methods to quantify soluble SOD1 species in patient-derived cell models of ALS. The highest levels of soluble disordered SOD1 were detected in induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived motor neuron and astrocytes cultures (MNACs) compared to fibroblasts, iPSCs and sensory neuron cultures. These results suggest that the selective vulnerability of motor areas to SOD1-ALS could derive from an enhanced burden of disordered SOD1.

To understand factors that might promote SOD1 unfolding, we focussed on the disulfide bond that is required for the stability of natively folded SOD1. Formation of the bond is oxygen-dependent and reduction of the bond promotes SOD1 unfolding. We studied the stability of SOD1 in patient-derived cells exposed to lowered oxygen tensions. This induced increases in disulfide-reduced, disordered mutant and wild-type SOD1. The response was time- and concentration-dependent and more pronounced in MNACs, where even increased aggregation of mutant SOD1 was observed. These results are consistent with the enhanced vulnerability of the motor system in ALS and suggest that conditions causing impaired oxygen perfusion could contribute to the initiation and progression of the disease.

Inclusions containing aggregated misfolded wild-type SOD1 have been found in sporadic ALS (sALS) patients without SOD1 mutations and those carrying mutations in genes other than SOD1. However, other groups have reported contrasting results and the contribution of misfolded wild-type SOD1 to ALS pathology is controversial. Guidelines for preservation, storage, and analysis of tissues under standardized conditions would facilitate the comparison of results between different laboratories. We established an optimized immunohistochemistry protocol to detect misfolded wild-type SOD1 in paraffin-embedded spinal cord samples from sALS patients. We also developed a method to immunocapture disordered SOD1 from frozen post-mortem tissue. High, but variable, levels of disordered SOD1 were detected in spinal cords from sALS patients. Our data support a possible pathological role of misfolded wild-type SOD1 in sALS.

Recent evidence suggests that SOD1 aggregates can induce templated aggregation of disordered SOD1 and spread from cell-to-cell via a prion-like mechanism. To test if antibodies could block this process in vivo, we conducted an immunotherapy study in a model of prion-like spread, where SOD1 aggregate seeds are inoculated into the lumbar spinal cord of SOD1G85R transgenic mice and lead to accelerated disease onset and progression. Novel monoclonal antibodies (mAb) against disordered domains of SOD1 aggregates were developed and validated for their reactivity to disordered and aggregated SOD1 species in vitro and in vivo. Immunotherapy using a mAb against the C-terminal end of SOD1 attenuated the onset and progression of prion-like SOD1 spread. However, no effect was seen on onset, duration or progression of the underlying disease. This suggests that, under the conditions tested, immunotherapy against disordered domains of SOD1 does not affect intracellular aggregation and additional strategies might be needed to reduce intracellular accumulation of misfolded SOD1 aggregation.

In conclusion, we show that conformation-specific antibodies are powerful tools to investigate disordered and potentially pathogenic species of SOD1 in various biochemical, cellular and in vivo contexts. The development of the novel immunocapture strategy could facilitate future research on characterizing SOD1 aggregates from mouse tissues, patient-derived cells or post-mortem tissues with the goal of determining their role in ALS disease pathogenesis.

Abstract [sv]

Mutationer i superoxiddismutas 1 (SOD1) genen kan orsaka den progressiva neurodegenerativa sjukdomen Amyotrofisk lateralskleros (ALS). ALSassocierade mutationer påverkar stabiliteten hos SOD1-proteinet och gör att det förlorar sin naturliga struktur. Det ostrukturerade muterade proteinet kan sedan fel-veckas och aggregera. Ansamlingar av aggregerat SOD1 protein i drabbade motoriska nervceller är ett välkänt fenomen, både hos patienter samt i transgena musmodeller för SOD1-ALS. Syftet med denna avhandling var att utveckla och karaktärisera nya antikroppar och metoder för att studera hur, och varför dessa sjukdomsassocierade SOD1 aggregat bildas, ansamlas och sprider sig vid ALS. Vårt slutgiltiga mål var att identifiera en antikropp som kunde användas för immunterapibehandling för att bromsa sjukdomen

SOD1 protein uttrycks i kroppens alla celltyper. Varför är det då specifikt ryggmärgens, och hjärnans motoriska nervceller och de omkringliggande stödjecellerna (astrocyter) som påverkas vid ALS, och bara där som aggregat av felveckat SOD1 bildas? För att förstå varför muterat SOD1 är specifikt farligt för motorsystemet odlade vi celler från ALS patienter i vårt laboratorium, och använde biokemiska metoder för att mäta mängden lösligt ostrukturerat SOD1 protein i olika celltyper. De högsta nivåerna av lösligt ostrukturerat SOD1 detekterades i celler som omprogrammerats till pluripotenta stamceller (iPSC), och sedan differentierats ut till motoriska nervceller och astrocyter. Vi jämförde med fibroblaster, iPSCs och iPSCs deriverade sensoriska nervceller. Våra resultat tyder på att den selektiva sårbarheten hos motorsystemet vid SOD1-ALS skulle kunna härledas till en ökad ansamling av ostrukturerat SOD1 protein i motoriska nervceller och astrocyter.

Vilka mijöfaktorer skulle kunna bidra till att SOD1 tappar sin naturliga struktur och börjar bilda aggregat? Här fokuserade vi på en disulfidbrygga som stärker stabiliteten hos normal-veckat SOD1 protein. Disulfidbryggan är syreberoende och reduktion av denna leder till ökad sannolikhet att SOD1 proteinet tappar sin normala struktur, kan fel-veckas och bilda aggregat. Vi studerade hur låg syrehalt påverkade disulfidbryggan och mängden ostrukturerat SOD1 i celler från patienter. Låg syrenivå ledde till reducerad disulfidbindning, och ökad mängd ostrukturerat SOD1 protein. Både celler med ALS-länkade mutationer i SOD1, och med normalt vildtypsprotein, påverkades av lågt syre, och effekten var tid- och koncentrationsberoende. Motoriska nervceller och astrocyter påverkades mest, och i dessa celler ledde låg syrehalt även till aggregering av mutant SOD1. Dessa resultat bidrar till att förklara motorsystemets sårbarhet vid ALS, och föreslår att tillstånd som orsakar nedsatt syresättning i nervsystemet kan bidra till sjukdomsutveckling.

Flera studier har rapporterat att det även bildas aggregat av felveckat vildtypsSOD1 i vävnad från patienter med sporadisk ALS (sALS), och patienter med mutation i andra ALS-länkade gener, utan SOD1-mutationer. Andra studier har dock rapporterat motsatt resultat, så både förekomst och betydelse av aggregerat vildtyps-SOD1 är kontroversiellt.

Vi har sammanställt gemensamma riktlinjer för fixering, lagring och analysprotokoll som skulle kunna underlätta jämförelsen av resultat från olika laboratorier. Vi beskriver i detalj ett etablerat, optimerat immunohistokemiprotokoll för att färga aggregerat vildtyps-SOD1 i vävnadssnitt från från sALS-patienter. Vi har också utvecklat en antikroppsbaserad metod för att detektera sjukdomsassocierat SOD1 i homogeniserad frusen ryggmärgsvävnad. Höga, men varierande, nivåer av ostrukturerat och felveckat SOD1 detekterades i vävnad från sALS-patienter. Våra resultat stöder hypotesen att felveckat vildtyps-SOD1 kan bidra till sjukdomsutveckling hos ALS-patienter utan SOD1 mutation.

Med mål att utveckla immunterapi mot SOD1-ALS producerade, och karaktäriserade vi monoklonala antikroppar som specifikt binder sjukdomsassocierat SOD1 protein. Tidigare studier tyder på att SOD1 aggregat kan få ostrukturerat SOD1 protein att börja aggregera och spridas från cell till cell via en prion-liknande mekanism. Vi använde en musmodell för ALS, som bygger på att en liten mängd aggregerat SOD1 injiceras i ryggmärgen hos transgena möss och leder till prion-liknande spridning av SOD1 aggregat, och progressiv ALSliknande förlamning. Immunoterapibehandling med hjälp av en av våra monoklonala antikroppar som binder den C-terminala änden av SOD1 kunde binda SOD1 aggregat in vivo, dämpade SOD1-aggregatens aktivitet och förlängde mössens överlevnad. Immunterapi behandling kunde däremot inte hämma start, progression eller förlänga överlevnad hos transgena möss som uttrycker muterat humant SOD1 och utvecklar ALS-liknande förlamningssjukdom. Våra resultat tyder på att antikroppsbaserad behandling kan bromsa extracellulär spridning av SOD1 aggregat men har svårt att komma in i motoriska nervceller och förhindra intracellulär SOD1 aggregering.

Sammanfattningsvis visar vi att strukturspecifika antikroppar är kraftfulla verktyg för att undersöka ostrukturerat och patogena arter av SOD1 protein i olika biokemiska, cellulära och in vivo studier. Utvecklingen av nya antikroppar och metoder kan underlätta ny forskning om de cellulära mekanismer som påverkar bildningen av patogena arter av SOD1 aggregat och nervcells död vid ALS.

Place, publisher, year, edition, pages
Umeå: Umeå university, 2019. p. 71
Series
Umeå University medical dissertations, ISSN 0346-6612 ; 2021
Keywords
ALS, antibodies, SOD1, disordered SOD1, patient-derived models, low oxygen tension, Immunotherapy
National Category
Clinical Medicine Neurology
Identifiers
urn:nbn:se:umu:diva-157036 (URN)978-91-7855-032-6 (ISBN)
Public defence
2019-03-29, Betula, Norrlands universitetssjukhus, Building 6M, NUS, Umeå, 09:00 (English)
Opponent
Supervisors
Available from: 2019-03-08 Created: 2019-03-06 Last updated: 2019-03-22Bibliographically approved

Open Access in DiVA

fulltext(2241 kB)101 downloads
File information
File name FULLTEXT02.pdfFile size 2241 kBChecksum SHA-512
7b9be04b926206cd2091a7588550b31d0e8b1915901838b836dfad852e19f2c1266cac8b1bb075a6dc534812786738c01fd7661df79c482bb40b8dec87e81feb
Type fulltextMimetype application/pdf

Other links

Publisher's full textPubMed

Authority records BETA

Keskin, IsilForsgren, ElinLehmann, ManuelaAndersen, Peter M.Nordström, UlrikaZetterström, PerMarklund, Stefan L.Gilthorpe, Jonathan D.

Search in DiVA

By author/editor
Keskin, IsilForsgren, ElinLehmann, ManuelaAndersen, Peter M.Brännström, ThomasNordström, UlrikaZetterström, PerMarklund, Stefan L.Gilthorpe, Jonathan D.
By organisation
PathologyClinical NeuroscienceDepartment of Pharmacology and Clinical NeuroscienceClinical chemistry
In the same journal
Acta Neuropathologica
Biochemistry and Molecular Biology

Search outside of DiVA

GoogleGoogle Scholar
Total: 126 downloads
The number of downloads is the sum of all downloads of full texts. It may include eg previous versions that are now no longer available

doi
pubmed
urn-nbn

Altmetric score

doi
pubmed
urn-nbn
Total: 353 hits
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf