Umeå University's logo

The biological function of proteins is critically dependent on dynamics inherent to the native structure. Such structural dynamics obey a predefined order and temporal timing to execute the specific reaction. Determination of the cooperativity of key structural rearrangements requires monitoring protein reactions in real time. In this work, we used time-resolved x-ray solution scattering (TR-XSS) to visualize structural changes in the Escherichia coli adenylate kinase (AdK) enzyme upon laser-induced activation of a protected ATP substrate. A 4.3-ms transient intermediate showed partial closing of both the ATP- and AMP-binding domains, which indicates a cooperative closing mechanism. The ATP-binding domain also showed local unfolding and breaking of an Arg131-Asp146 salt bridge. Nuclear magnetic resonance spectroscopy data identified similar unfolding in an Arg131Ala AdK mutant, which refolded in a closed, substrate-binding conformation. The observed structural dynamics agree with a “cracking mechanism” proposed to underlie global structural transformation, such as allostery, in proteins.

Proteins are biological macromolecules capable of accelerating biochemical reactions. To accomplish this, proteins undergo changes in their molecular structure. Advances in structural biology have resulted in ever-increasing numbers of high-resolution protein structures. However, the majority of transient intermediate states will not amendable with traditional structural determination methods. Therefore, understanding how protein structural changes are correlated with the biological function necessitates development of methods that characterize the reaction in the native environment. P-type ATPase membrane transporters and the adenylate kinase (AK) are two ATP-dependent proteins that undergo extensive conformational change in their reaction cycles. While P-type ATPases maintain concentration gradients of ions across the cellular membranes, AK regulates cellular energy homeostasis by catalyzing interconversion of nucleotides. Resolving P-type ATPase and AK temporal and spatial structural dynamics is crucial to understand how these proteins are triggered by ATP for functionality. 

To pave way for time-resolved X-ray characterization of ATP-dependent conformational changes, it was necessary to identify optimal conditions for triggering protein reactions. Therefore, time-dependent Fourier-Transform Infra-Red (FTIR) spectroscopy of a recombinant Zn²⁺-transporting ATPase was used to optimize activation by photolysis of caged ATP. These conditions were then used to track structural dynamics of the Ca²⁺-transporting sarcoplasmic reticulum ATPase (SERCA) in skeletal muscle native membranes. Fast single-cycle dynamics were registered with the formation of an intermediate state at 1.5 ms followed by steady-state accumulation at 13 ms. The molecular dynamic (MD)-based structural refinement procedure showed that the 13-ms transient intermediate represented an ADP-sensitive, phosphorylated Ca²⁺-bound E1 state (Ca₂E1P), with a domain arrangement that has so far eluded structural characterization.

MD simulations of the identified SERCA transient intermediates further finetuned their positions in the reaction cycle. The 1.5-ms state was assigned to an ATP-bound state prior to phosphorylation, while the 13-ms state was stable in its Ca₂E1P conformation. Because the simulations were performed in multicomponent lipid bilayers mimicking the native membrane, specific state-dependent lipid interactions were also identified. 

Finally, the wider applicability of the time-resolved X-ray method to study ATP-dependent protein dynamics was demonstrated by tracking AK structural dynamics. A transient intermediate at 5 ms was identified that showed closing of the ATP-binding domain prior to the NMP-binding domain, in the presence of both ATP and AMP substrates. This study provided conclusive experimental proof of the relative ordering of domain closure that had been predicted by several computational studies.In summary, the work presented in this thesis has contributed to developing the time-resolved X-ray method to study the structural dynamics of ATP-dependent proteins.

Populärvetenskaplig sammanfattning

Proteiner är biologiska makromolekyler vars arbetsuppgifter i cellen möjliggör liv. Föratt kunna utföra sina tillordnade funktioner måste proteinets struktur i många fallförändras. Denna inneboende dynamik är inkodad i proteinets aminosyrasekvens ochhar optimerats genom evolutionsprocessen. I många fall finns det molekyler som kanstarta igång ett visst proteins funktion. En sådan molekyl är adenosintrifosfat (ATP)som är en organisk förening som tillhandahåller energi till ATP-beroende proteiner.Ett exempel är P-typs ATPaser som är proteiner insprängda i cellens membran somtransporterar olika joner. Denna transport möjliggörs av proteinets strukturellaförändringar som sätts igång av energi tillförd av ATP molekylen. Även proteinet somreglerar tillgången av ATP i cellen genomgår stora konformationsförändringar. Dettaprotein är adenylatkinas (AK) och katalyserar interkonversion av nukleotider. För attförstå hur dessa proteiner kan startas igång av ATP molekylen är det därför viktigt attbestämma hur deras strukturer förändras över tid till följd av tillgång på ATP.

För P-typs ATPaser har ett stort antal strukturer av olika intermediära tillståndbestämts främst genom röntgenkristallografi. Dock så kommer det finnas instabilatillstånd som aldrig kommer att kunna fångas av traditionellastrukturbestämningsmetoder. Utöver detta så är det möjligt att proteinet inte kangenomgå sina naturliga strukturförändringar i en proteinkristall. För ettmembranprotein är dessutom funktionen beroende av dess omgivande lipidmembran.För att bättre förstå proteinets funktion är det därför viktigt att försöka studera denaktuella processen under förhållanden så nära som möjligt till de fysiologiskaförhållandena som råder i cellen.

Denna avhandling syftade till att vidareutveckla en existerande tidsupplöströntgenspridningsteknik (TR-XSS) för att karakterisera ATP-beroendeproteindynamik i lösning. För att erhålla en tillräckligt stark signal i dessa experimentmåste en stor del av proteinerna i provet utföra sin funktion samtidigt. Detta kanuppnås genom laseraktivering. Vi använde laseraktivering av en burförening av inaktivATP för att starta transportreaktionen för en zinktransportör från den patogenabakterien Shigella sonnei. Genom att följa signalen från ATP hydrolys med infrarödspektroskopi hittades lämpliga betingelser för TR-XSS synkrotronexperiment.Förutom att bana vägen för tidsupplösta röntgenförsök är kinetiken ochstrukturdynamiken av intresse eftersom denna zinktransportör är vanligtförekommande hos patogena bakterier men inte hos människor och därför utgör ettpotentiellt målprotein för utveckling av nya antibiotika.

Vid utvecklingen av TR-XSS-metoden användes laseraktivering av en ATP burföreningför att studera en strukturellt väl-karakteriserad kalciumtransportör (SERCA) i dessnaturliga membranmiljö istället för i proteinkristaller. Experimenten identifierade ettintermediärt tillstånd vid 1.5 millisekunder och ackumuleringen av ett annat hastighetsbegränsande intermediärt tillstånd vid 13 millisekunder. Med hjälp avmolekyldynamikdatorsimuleringar (MD) bestämdes sedan strukturen av dethastighetsbegränsande tillståndet i en konformation som ännu inte hade observeratsmed traditionella strukturbestämningsmetoder. MD-simulering avstrukturmodellerna erhållna från TR-XSS-metoden i membranmodeller somimiterade den naturliga lipidsammansättningen finjusterade placeringen av debestämda tillstånden i SERCA-reaktionscykeln samt karakteriserade deras interaktionmed de omgivande lipiderna.

Den utvecklade TR-XSS-metoden användes sedan för att studera ATP-beroendeproteindynamik för AK. Resultaten visade experimentellt den relativa ordningen på destrukturella förändringar som proteinet genomgår som respons på ATP tillgång. Dettavisar på bredden hos den utvecklade röntgenmetoden. Dessutom finns flera olika typerav burföreningar tillgängliga, såsom metaboliter, joner, och signalsubstanser, vilketytterligare öppnar upp för möjliga målproteiner.

Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase (SERCA) transporters regulate calcium signaling by active calcium ion reuptake to internal stores. Structural transitions associated with transport have been characterized by x-ray crystallography, but critical intermediates involved in the accessibility switch across the membrane are missing. We combined time-resolved x-ray solution scattering (TR-XSS) experiments and molecular dynamics (MD) simulations for real-time tracking of concerted SERCA reaction cycle dynamics in the native membrane. The equilibrium [Ca-2] E1 state before laser activation differed in the domain arrangement compared with crystal structures, and following laser-induced release of caged ATP, a 1.5-ms intermediate was formed that showed closure of the cytoplasmic domains typical of E1 states with bound Ca2+ and ATP. A subsequent 13-ms transient state showed a previously unresolved actuator (A) domain arrangement that exposed the ADP-binding site after phosphorylation. Hence, the obtained TR-XSS models determine the relative timing of so-far elusive domain rearrangements in a native environment.

P‐type ATPase proteins maintain cellular homeostasis and uphold critical concentration gradients by ATP‐driven ion transport across biological membranes. Characterization of single‐cycle dynamics by time‐resolved X‐ray scattering techniques in solution could resolve structural intermediates not amendable to for example crystallization or cryo‐electron microscopy sample preparation. To pave way for such time‐resolved experiments, we used biochemical activity measurements, Attenuated Total Reflectance (ATR) and time‐dependent Fourier‐Transform Infra‐Red (FTIR) spectroscopy to identify optimal conditions for activating a Zn2+‐transporting Type‐I ATPase from Shigella sonnei (ssZntA) at high protein concentration using caged ATP. The highest total activity was observed at a protein concentration of 25 mg/mL, at 310 K, pH 7, and required the presence of 20% (v/v) glycerol as stabilizing agent. Neither the presence of caged ATP nor increasing lipid‐to‐protein ratio affected the hydrolysis activity significantly. This work also paves way for characterization of recombinant metal‐transporting (Type‐I) ATPase mutants with medical relevance.