Umeå University's logo

umu.sePublications
Change search
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf
Cytokine mRNA and protein expression by cell cultures of epithelial ovarian cancer: Methodological considerations on the choice of analytical method for cytokine analyses
Umeå University, Faculty of Medicine, Department of Clinical Sciences, Obstetrics and Gynecology. Umeå University, Faculty of Medicine, Department of Clinical Microbiology, Clinical Immunology.
Umeå University, Faculty of Medicine, Department of Clinical Microbiology, Clinical Immunology.
Umeå University, Faculty of Medicine, Department of Clinical Microbiology, Clinical Immunology.
Umeå University, Faculty of Medicine, Department of Medical Biosciences, Pathology.
Show others and affiliations
2020 (English)In: American Journal of Reproductive Immunology, ISSN 1046-7408, E-ISSN 1600-0897, Vol. 84, no 1, article id e13249Article in journal (Refereed) Published
Abstract [en]

Problem: To get a comprehensive picture of cytokine expression in health and disease is difficult, cytokines are transiently and locally expressed, and protein analyses are burdened by biological modifications, technical issues, and sensitivity to handling of samples. Thus, alternative methods, based on molecular techniques for cytokine mRNA analyses, are often used. We compared cytokine mRNA and protein expression to evaluate whether cytokine mRNA profiles can be used instead of protein analyses.

Method of study: In kinetic experiments, cytokine mRNA and protein expression of IL-1 beta, IL-6, IL-8, TNF-alpha, and TNF-beta/LTA were studied using real-time RT-qPCR and Luminex(R) microarrays in the ovarian cancer cell lines OVCAR-3, SKOV-3 and the T-cell line Jurkat, after activation of transcription by thermal stress. In addition, we analyzed IL-6 and IL-8 mRNA and protein in a small number of ovarian cancer patients.

Results: Ovarian cancer cells can express cytokines on both mRNA and protein level, with 1-4 hours' time delay between the mRNA and protein peak and a negative Spearman correlation. The mRNA and protein expression in patient samples was poorly correlated, reflecting previous studies.

Conclusion: Cytokine mRNA and protein expression levels show diverging results, depending on the material analyzed and the method used. Considering the high sensitivity and reproducibility of real-time RT-qPCR, we suggest that cytokine mRNA profiles could be used as a proxy for protein expression for some specific purposes, such as comparisons between different patient groups, and in defining mechanistic pathways involved in the pathogenesis of cancer and other pathological conditions.

Place, publisher, year, edition, pages
John Wiley & Sons, 2020. Vol. 84, no 1, article id e13249
Keywords [en]
cytokine, mRNA, ovarian cancer, protein, protein microarray, real-time polymerase chain reaction
National Category
Immunology in the medical area
Identifiers
URN: urn:nbn:se:umu:diva-171392DOI: 10.1111/aji.13249ISI: 000530699700001PubMedID: 32307767Scopus ID: 2-s2.0-85085074930OAI: oai:DiVA.org:umu-171392DiVA, id: diva2:1439728
Available from: 2020-06-12 Created: 2020-06-12 Last updated: 2023-03-24Bibliographically approved
In thesis
1. Mechanisms for immune escape in epithelial ovarian cancer
Open this publication in new window or tab >>Mechanisms for immune escape in epithelial ovarian cancer
2021 (English)Doctoral thesis, comprehensive summary (Other academic)
Abstract [en]

Tumors develop mechanisms to subvert the immune system, constituting immune escape. Epithelial ovarian cancer (EOC), the deadliest of all gynecological malignancies, uses a variety of mechanisms to undermine immune surveillance, aiding its establishment and metastatic spreading. Despite progress in oncoimmunology, a lot remains unknown about the cancer-immune system interplay. The aim of this thesis was to study tumor-mediated mechanisms for immune escape in EOC patients, focusing on the role of cytokines and EOC- derived exosomes. 

Cytokines are key molecules regulating immune effector functions in health and disease. We used real-time RT-qPCR and a set of primers and probes for 12 cytokines, discriminating between different immune responses and compared the cytokine mRNA expression profiles locally in the TME and systemically in peripheral blood immune cells of EOC patients, to women with benign ovarian conditions and women with normal ovaries. The cytokine mRNA expression was in general most prominent in EOC patients, confirming the immunogenicity of EOC. We found significant dominance of inflammatory and immunosuppressive/ regulatory cytokines, known to promote tumor progression by priming and activating T regulatory cell-mediated immune suppression. In contrast, IFN-γ, crucially important for evoking a cytotoxic anti-tumor response, was not upregulated. Instead, a systemic increase of IL-4 prevailed, deviating the immune defense towards humoral immunity. With regard to our cytokine study, we performed comparative analyses of cytokine mRNA versus protein expression in the EOC cell lines OVCAR-3 and SKOV-3. We found that cytokine mRNA signals were universally detected, and in some instances translated into proteins, but the protein expression levels depended on the material analyzed and the method used. Due to the high sensitivity of real-time RT-qPCR, we suggest that cytokine mRNA expression profiles can be used for some instances, such as in studies of mechanistic pathways and in comparisons between patient groups, but cannot replace expression at the protein level. 

Exosomes are nanometer-sized vesicles of endosomal origin, released by virtually all cells, participating in normal and pathological processes. Like many tumors, EOC is a great exosome producer. We isolated exosomes from EOC ascitic fluid and supernatant from tumor explant cultures to study their effect on the NK cell receptors NKG2D and DNAM-1, involved in tumor killing. We found that EOC exosomes constitutively expressed NKG2D ligands on their surface while DNAM-1 ligand expression was rare and not associated with the exosomal membrane. Consistently, the major cytotoxic pathway of NKG2D-mediated killing was dysregulated by EOC exosomes while the accessory DNAM-1- mediated pathway remained unchanged. Our results provide a mechanistic explanation to the previously made observation that in EOC patients, tumor killing is only dependent on the accessory DNAM-1 pathway. Following these iii iv results, we studied NKG2D-mediated cytotoxicity in vivo in EOC patients before and after surgery. We found that the serum exosomes isolated from EOC patients were able to downregulate the NKG2D receptor and suppress NKG2D-mediated cytotoxicity in NK cells from healthy donors, in a similar way as exosomes from EOC ascites. We also found that surgery of the primary EOC tumor has a beneficial effect on the patients’ anti-tumor cytotoxic immune response. One mechanistic explanation could be a decrease in circulating NKG2D ligand- expressing exosomes, thus improving the cytotoxic NK cell function. 

In conclusion, our results contribute to the understanding of the mechanisms responsible for tumor immune escape in general, and in EOC patients in particular, and might be useful in developing novel antitumor therapies. Our studies highlight the prevailing immunosuppression in the local TME and the immunosuppressive role of EOC exosomes. Furthermore, they support the notion that cancer surgery is also a way of removing exosome-producing cells and reducing the serum concentration of immunosuppressive exosomes, thus boosting the patients’ cytotoxic anti-tumor response. 

Abstract [sv]

Äggstockscancer är den dödligaste av alla gynekologiska cancersjukdomar. Sjukdomen ger sällan några symtom hos kvinnan förrän den har spridit sig och upptäcks således oftast sent. Därför är det viktigt att genom forskning försöka förstå mekanismerna bakom cancerns spridning och hitta markörer för tidigare diagnostik och nya sätt att behandla sjukdomen. En del av vårt immunförsvar är programmerat för att kunna känna igen och eliminera förändrade eller skadade celler, exempelvis cancerceller. Ibland utvecklar cancerceller en förmåga att nedreglera och undkomma immunförsvaret. När det sker märker inte kroppen att en tumör bildas och sprids. Syftet med denna avhandling var att studera biologiska mekanismer som ger äggstockscancer förmåga att inaktivera immunförsvaret. Äggstockscancer är nämligen en tumörtyp som har utvecklat flera mekanismer för att nedreglera kroppens immunförsvar i syfte att undvika upptäckt. Det är ännu inte helt klarlagt hur detta går till. För att försöka förstå hur äggstockscancer kan undkomma immunförsvaret har vi i detta forsknings- projekt undersökt cytokiner i tumörvävnad och exosomer som tumören utsöndrar. Cytokiner är proteiner som agerar som lösliga signalmolekyler. Exosomer är mycket små ”signalbubblor” som innehåller olika molekyler som också finns i deras modercell. Cytokiner och exosomer utsöndras av såväl kroppens friska som sjuka celler för att cellerna ska kunna kommunicera med varandra utan att vara i direkt kontakt. 

I det första delarbetet kartlades nivåerna av cytokin-mRNA, dvs. det genetiska förstadiet till cytokinproteiner, i tumörvävnad och i cirkulerande vita blodkroppar från kvinnor med äggstockscancer, och jämfördes med motsvarande uttryck hos kvinnor med godartade tillstånd i äggstockarna och kvinnor med normala äggstockar. Vi fann förhållandevis högre uttryck av cytokin-mRNA hos cancerpatienterna vilket tyder på att immunförsvaret i större utsträckning är aktiverat hos dem. Vidare dominerade nedreglerande och inflammatoriska cytokin-mRNA hos kvinnor med äggstockscancer. Cytokin-mRNA som är viktiga för vårt eget cancerförsvar och kroppens egna mördarceller visades vara nedreglerade. Mönstret sågs också i cirkulerande vita blodkroppar, vilket visar att tumören har en förmåga att påverka immunförsvaret, inte bara lokalt i tumören, utan i hela kroppen. 

I delarbete II undersökte vi sambandet mellan cytokinernas mRNA respektive proteinuttryck. Proteinet är aktivt i kroppen medan mRNA är dess genetiska förstadium. Eftersom cytokinproteiner endast uttrycks kortvarigt och lokalt samt påverkas mycket av hur ett prov tas och senare hanteras i laboratoriet, är det svårt att dra slutsatser av en proteinanalys. I en modell med odlade cancerceller jämförde vi skillnaden mellan cytokinernas mRNA- och proteinuttryck. Vi fann att metoden för proteinanalys har ett snävt spann för att kunna upptäcka protein. Om inget protein kan detekteras behöver det inte betyda att det inte finns utan provet kan behöva spädas eller koncentreras. Analys av mRNA är mindre v vi ömtåligt och har hög träffsäkerhet. Vi fann att äggstockscancerceller producerade cytokin-mRNA som kan leda till mätbara proteinnivåer. Det finns vissa fördelar med mRNA-analysen som gör att den kan användas t ex för att kartlägga en individuell cytokin mRNA-profil som kan användas vid diagnostik eller behandling. 

I delarbete III analyserades exosomer utsöndrade av äggstockscancer i form av odlade celler, vävnad, blod och ascites. Ascites är vätska i bukhålan som kvinnor med äggstockscancer kan utveckla. Vi ville undersöka om exosomer utsöndrade av cancerceller påverkar kroppens mördarceller. Vid äggstockscancer förefaller en aktiverande signalväg i mördarcellerna delvis vara utslagen. Vår hypotes var att exosomerna orsakar detta. Signalen går via något som kallas ligand- receptorsystem. En ligand är en molekyl som kan binda till en mottagarmolekyl (receptor) fäst på mördarcellernas yta. När liganden binder till receptorn får mördarcellen en signal om att den ska aktiveras och döda en målcell. Vi fann att äggstockscancer-exosomer uttrycker ligander för receptorn NKG2D på sin yta. Det är den viktigaste signalvägen i avdödandet av cancerceller. På så vis agerar exosomerna ”lockbete” och lurar mördarcellerna att nedreglera sina NKG2D- receptorer. Därmed aktiveras inte mördarcellerna för att döda cancerceller. En mindre effektiv receptor, DNAM-1, verkar istället dominera avdödande av äggstockscancerceller. Vi fann att dess ligander inte uttrycks på exosomernas yta och således lämnas denna bana opåverkad. 

Om en tumör kan opereras bort i sin helhet förbättras kvinnans prognos avseende överlevnad. I delarbete IV ville vi studera effekten av kirurgi genom att undersöka blodprover tagna före och efter operationen. Vi undersökte hur en operation påverkar mängden exosomer i blodet, de molekyler som exosomerna uttrycker och om effektiviteten hos kvinnans mördarceller påverkas. Oavsett om hela tumören opererats bort eller inte kunde vi hos samtliga patienter se en förbättrad funktion hos mördarcellerna efter operationen. En möjlig förklaring till detta är den minskade mängden exosomer i blodet som kunde observeras hos en grupp patienter efter kirurgi. Dessa kvinnor hade dessutom ett högre uttryck av NKG2D receptorn hos mördarcellerna efter operationen. 

Sammanfattningsvis har vi funnit nya mekanismer för hur äggstockscancer nedreglerar och undkommer immunförsvaret. Förhoppningsvis kan denna nya kunskap utgöra ytterligare en pusselbit i sökandet efter nya diagnostiska verktyg, nya effektiva behandlingar och i förlängningen bidra till en förbättrad överlevnad för kvinnor som drabbas av äggstockscancer. 

Place, publisher, year, edition, pages
Umeå: Umeå universitet, 2021. p. 68
Series
Umeå University medical dissertations, ISSN 0346-6612 ; 2119
Keywords
human, ovarian cancer, high-grade serous cancer, EOC, HGSC, HGSOC, tumor microenvironment, immune escape, immune suppression, cytokines, exosomes, NKG2D, MICA/B, ULBP1-3, DNAM-1, surgery
National Category
Obstetrics, Gynecology and Reproductive Medicine Cancer and Oncology Immunology in the medical area
Research subject
Obstetrics and Gynaecology
Identifiers
urn:nbn:se:umu:diva-180917 (URN)978-91-7855-484-3 (ISBN)978-91-7855-483-6 (ISBN)
Public defence
2021-03-26, Betula, målpunkt L0, plan 0, NUS, UMEÅ, 09:00 (Swedish)
Opponent
Supervisors
Available from: 2021-03-05 Created: 2021-03-02 Last updated: 2021-03-04Bibliographically approved

Open Access in DiVA

fulltext(1062 kB)333 downloads
File information
File name FULLTEXT02.pdfFile size 1062 kBChecksum SHA-512
0bf1c3fed9ca47d0b333cde8d58f01934fd754b4534737623a9a8d93870cffa9933648e39e47d1d1dbd6cc98d64efaa4914b00ff83c98c03654019bf2e765649
Type fulltextMimetype application/pdf

Other links

Publisher's full textPubMedScopus

Authority records

Israelsson, PernillaDehlin, EvaNagaev, IvanLundin, EvaOttander, UlrikaMincheva-Nilsson, Lucia

Search in DiVA

By author/editor
Israelsson, PernillaDehlin, EvaNagaev, IvanLundin, EvaOttander, UlrikaMincheva-Nilsson, Lucia
By organisation
Obstetrics and GynecologyClinical ImmunologyPathology
In the same journal
American Journal of Reproductive Immunology
Immunology in the medical area

Search outside of DiVA

GoogleGoogle Scholar
Total: 361 downloads
The number of downloads is the sum of all downloads of full texts. It may include eg previous versions that are now no longer available

doi
pubmed
urn-nbn

Altmetric score

doi
pubmed
urn-nbn
Total: 531 hits
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf