Umeå University's logo

Plastic materials are an inseparable part of everyday life, but their widespread use comes with significant environmental challenges. The OECD reports that global plastics pro­duction has exceeded 400 Mt per year in recent years, and plastic pollution is now detected even in remote ecosystems. Growing interest is therefore directed toward bio­plastics that are biologically produced and/or biodegradable. Polyhydroxyalkanoates (PHA) are a family of biodegradable and biocompatible polyesters produced by micro­organisms as intracellular storage granules. PHAs consist of 3-hydroxy acid monomer units and can exhibit diverse and attractive material properties depending on their monomer composition. This thesis explores multiple stages of the PHA life cycle – from screening and fermentation to downstream recovery and end-of-life valorization – through the principles of green chemistry and within the broader framework of an inte­grated biorefinery concept.

At the beginning of the PHA life cycle, or even before production itself, small-scale screening is important for identifying promising bacterial strains and suitable cultiva­tion media for growth and PHA production. This topic was investigated in Paper I, where two bacterial species, Halomonas sp. R5-57, a short-chain-length PHA producer, and Pseudomonas sp. MR4-9, a medium-chain-length PHA producer, were screened in high-throughput mode by cultivation in 96-well plates followed by Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR). Selected results were subsequently quantified and con­firmed at a larger cultivation scale. This study demonstrated that high-throughput screening is a powerful tool for evaluating large numbers of cultivation conditions, particularly different carbon sources, and for selecting the most promising candidates for confirmation at a larger scale. From a biorefinery perspective, this approach could also support the rapid assessment of waste streams or renewable raw materials as potential substrates for PHA production.

Upstream processing was further investigated in Paper II, with a focus on lowering feedstock costs by using crude industrial glycerol as an alternative carbon source for Photobacterium ganghwense C2.2 and comparing it with pure glycerol. Crude glycerol supported faster biomass formation but resulted in lower overall PHA production and lower polymer molecular weight, while enabling recovery of fatty acid impurities from the crude feedstock. The use of an inexpensive crude substrate to obtain higher biomass formation and lower-molecular-weight PHA provides a relevant perspective for inte­grated biomass valorization, especially when such materials can be further converted into higher-value products.

Since downstream processing strongly affects both process economics and sustain­ability, Paper III evaluated dihydrolevoglucosenone, commercially known as Cyrene, as a biobased and biodegradable extraction solvent, with emphasis on solvent reuse and avoidance of toxic solvent waste. In an integrated process concept, spent biobased solvent that can no longer be reused may also be considered for energy recovery. The extraction process was optimized at small scale using design of experiments and multi­variate modeling, targeting extraction yield and polymer molecular weight. Based on the optimized conditions, upscaling experiments in a stirred cell were performed and showed improved extraction performance under scaled conditions.

Finally, PHAs were explored not only from an end-of-life perspective, but also as sub­strates for valorization and quality restoration. Low-molecular-weight PHA can be de­polymerized into monomers or platform chemicals and potentially repolymerized into higher-quality polymers, offering a strategy for upgrading materials such as the PHA obtained from crude glycerol in Paper II. Paper IV investigated the selective convers­ion of PHB to crotonic acid (CA) in the basic ionic liquid [EMIM][AcO], which acts as both solvent and catalyst. Paper V examined acid-catalyzed hydrolysis using a Brønsted-acid ionic liquid, [ImSO₃H][p-TsO], in a biphasic water/MIBK system, enabling the formation of mainly 3-hydroxybutyric acid (3-HBA), with CA as a bypro­duct, and facilitating phase separation between the products and the ionic liquid cata­lyst. In Paper VI, p-toluenesulfonic acid (p-TsOH)-catalyzed alcoholysis of PHB was demonstrated using methanol and ethanol, highlighting process flexibility by enabling subsequent hydrolysis in the same reactor after solvent/reactant exchange.

Fastän plastmaterial är en oskiljaktig del av vardagen, medför den utbredda användning­en betydande miljöutmaningar. Enligt OECD har den årliga globala plastproduktionen över­stigit 400 Mt de senaste åren och plastförorening utgör ett problem även i avlägsna eko­system. Växande intresse riktas därför mot bioplaster som är biologiskt producerade och/eller biologiskt nedbrytbara. Polyhydroxialkanoater (PHA) är en familj av biolog­iskt nedbrytbara och biokompatibla polyestrar som produceras av mikroorganismer i form av intracellulära lagringsgranuler. PHA består av 3-hydr­oxisyror med varierande sidokedjor som gemensamma monomera byggstenar och de kan uppvisa olika och att­raktiva materialegenskaper beroende på monomersammansättning. Denna avhandling utforskar flera steg i polyhydroxialkanoaternas livscykel – från screening och fermente­ring till nedströmsåtervinning och utvinning vid livscykelns slut – genom principerna för grön kemi och inom den bredare ramen för ett integrerat bioraffinaderikoncept.

I början av en PHA:s livscykel, eller till och med före själva produktionen, är småskalig screening viktig för att identifiera lovande bakteriestammar och lämpliga odlingsmedier för tillväxt och PHA-produktion. Detta ämne undersöktes i Artikel I, där två bakterie­arter, Halomonas sp. R5-57, en PHA-producent med kort kedjelängd, och Pseudomonas sp. MR4-9, en PHA-producent med medellånga kedjor, screenades i högkapacitetsläge genom odling i 96-brunnsplattor följt av analys med Fourier-transform infrarödspektro­skopi (FTIR). Utvalda resultat kvantifierades och bekräftades därefter i större odlings­skala. Denna studie visade att högkapacitetsscreening är ett kraftfullt verktyg för att ut­värdera ett stort antal odlingsförhållanden, i synnerhet olika kolkällor, och för att välja de mest lovande kandidaterna för bekräftelse i större skala. Ur ett bioraffinaderiperspek­tiv skulle denna metod också kunna stödja snabb bedömning av avfallsströmmar eller förnybara råvaror som potentiella substrat för PHA-produktion.

Uppströmsbearbetning undersöktes vidare i Artikel II, med fokus på att sänka råmate­rialkostnaderna genom att använda rå industriell glycerol som en alternativ kolkälla för Photobacterium ganghwense C2.2 och jämföra den med ren glycerol. Användning av rå glycerol resulterade i snabbare biomassabildning, men lägre total PHA-produktion och lägre molekylvikt for de producerade polymererna, samtidigt som det gav möjlighet att åter­vinna av fettsyraföroreningar från råmaterialet. Användningen av ett billigt råsubst­rat för att uppnå hög biomassabildning och PHA med lägre molekylvikt ger ett relevant perspektiv för integrerad biomassavärdering, särskilt när sådana material kan omvand­las ytterligare till produkter med högre värde.

Eftersom nedströmsbearbetning starkt påverkar både processekonomi och hållbarhet, utvärderade Artikel III dihydrolevoglukosenon, kommersiellt känt som Cyrene, som ett biobaserat och biologiskt nedbrytbart lösningsmedel for extraktion av PHA, med målet att återanvända lösningsmedlet och undvika av giftigt lösningsmedelsavfall. I ett integrerat processkoncept kan använt biobaserat lösningsmedel som inte längre kan återanvändas också övervägas för energiåtervinning. Extraktionsprocessen optimerades i liten skala med hjälp av experimentdesign och multivariat modellering, med inriktning på extraktionsutbyte och polymermolekylvikt. Baserat på de optimerade förhållandena utfördes uppskalningsexperiment i en omrörd cell och visade förbättrad extraktionspre­standa under uppskalade förhållanden.

Slutligen undersöktes PHA inte bara ur ett livscykelperspektiv, utan även som substrat för värdeökning och kvalitetsåterställning. Lågmolekylära PHA kan depolymeriseras till monomerer eller plattformskemikalier och potentiellt repolymeriseras till polymerer av högre kvalitet, vilket erbjuder en strategi för att uppgradera material som PHA som er­hålls från rå glycerol i Artikel II. Artikel IV undersökte den selektiva omvandlingen av PHB till krotonsyra (CA) i den basiska jonvätskan [EMIM][AcO], som fungerar som både lösningsmedel och katalysator. Artikel V undersökte syrakatalyserad hydrolys med användning av en jonvätska med Brønstedsura egenskaper, [ImSO₃H][p-TsO], i ett tvåfasigt vatten/MIBK-system, vilket möjliggör bildandet av huvudsakligen 3-hydr­oxismörsyra (3-HBA), med CA som biprodukt, och underlättar fasseparation mellan produkterna och den joniska vätskan som utgör katalysator. I Artikel VI demonstrera­des p-toluensulfonsyra (p-TsOH)-katalyserad alkoholys av PHB med användning av metanol och etanol, vilket belyser processflexibilitet genom att möjliggöra efterföljande hydrolys i samma reaktor efter lösningsmedels-/reaktantutbyte.

Tworzywa polimerowe są nieodłącznym elementem codziennego życia, jednak ich powszechne stosowanie wiąże się z istotnymi wyzwaniami środowiskowymi. Według OECD roczna, globalna produkcja tworzyw sztucznych przekroczyła w ostatnich latach 400 Mt, a zanieczyszczenia polimerowe są wykrywane nawet w odległych ekosyste-mach. Z tego powodu rośnie zainteresowanie biotworzywami pochodzącymi ze źródeł odnawialnych i/lub ulegającymi biodegradacji. Polihydroksyalkaniany (PHA) stano­wią rodzinę biodegradowalnych i biokompatybilnych biopoliestrów, produkowanych jako wewnątrzkomórkowy materiał zapasowy przez mikroorganizmy. Jednostkami powtarzalnymi PHA są kwasy 3-hydroksyalkanowe. W zależności od składu mono-merowego PHA mogą wykazywać zróżnicowane właściwości. Niniejsza rozprawa obejmuje analizę wybranych etapów życia PHA, od wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS, ang. high-throughput screening) i fermentacji bakteryjnej, poprzez ekstrakcję i oczyszczanie produktu, aż po waloryzację na końcu cyklu życia, w oparciu o zasady zie­lonej chemii oraz w szerszym kontekście koncepcji biorafinerii.

Na etapie wstępnym, poprzedzającym właściwą produkcję PHA, badania przesiewowe w małej skali są kluczowe dla wyboru obiecujących szczepów oraz warunków hodowli sprzyjających wzrostowi i biosyntezie PHA. Zagadnienie to podjęto w Pracy I, w której dwa szczepy bakterii, Halomonas sp. R5-57 (prowadzący do syntezy krótkich łańcu­chów PHA, scl-PHA, ang. short-chain-length PHA) oraz Pseudomonas sp. MR4-9 (pro­wadzący do syntezy PHA o średniej długości łańcucha, mcl-PHA, ang. medium-chain-length PHA), przebadano w trybie HTS poprzez hodowlę w płytkach 96-dołkowych i analizę metodą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR). Najbardziej obiecujące warunki zweryfikowano następnie w większej skali, a zawartość polimeru potwierdzono ilościowo. Wyniki wskazały, że HTS pozwala na sprawną ocenę znacznej liczby zróżnicowanych warunków, w szczególności odmiennych źródeł węgla, oraz wytypowanie parametrów do dalszych badań w większej skali. Z perspektywy bio­rafinerii może to ułatwiać szybką ocenę frakcji odpadowych i surowców odnawialnych jako potencjalnych substratów do produkcji PHA.

Etap hodowli i produkcji PHA analizowano następnie w Pracy II, koncentrując się na obniżeniu kosztów surowca. Porównano efektywność wykorzystania gliceryny przemy­słowej jako alternatywnego źródła węgla dla Photobacterium ganghwense C2.2 w stosun­ku do analogicznego procesu z zastosowaniem czystej gliceryny. Gliceryna przemysło­wa sprzyjała szybszemu przyrostowi biomasy, jednak prowadziła do niższej wydajności produkcji PHA oraz polimeru o niższej masie molowej, jednocześnie umożliwiając odzyskiwanie zanieczyszczeń kwasami tłuszczowymi z przemysłowego substratu. Wykorzystanie taniego, nieoczyszczonego substratu do uzyskania większej ilości biomasy oraz PHA o niższej masie cząsteczkowej może odgrywać znaczącą rolę w zintegrowanej waloryzacji biomasy, zwłaszcza gdy taki materiał jest przeznaczony jako surowiec do syntezy produktów o wyższej wartości.

Odzysk i oczyszczanie produktu istotnie wpływają zarówno na ekonomikę procesu, jak i jego zrównoważony charakter, w Pracy III opisano zastosowanie dihydrolewogluko­zononu (Cyrene) jako biopochodnego i biodegradowalnego rozpuszczalnika ekstrak­cyjnego. Szczególny nacisk położono na możliwość wielokrotnego wykorzystania roz­puszczalnika oraz ograniczenie obciążeń środowiskowych wynikających ze stosowania rozpuszczalników toksycznych. W ujęciu procesowym zużyty rozpuszczalnik biopo­chodny, nienadający się do ponownego użycia, może być również rozważany pod kątem odzysku energii. Proces zoptymalizowano w małej skali z wykorzystaniem planowania eksperymentów (DoE- ang. design of experiments) i modelowania wielowymiarowego, skupiając się na wydajności ekstrakcji oraz masie molowej polimeru. Dla wytypowa­nych optymalnych warunków przeprowadzono następnie próby skalowania w reakto-rze z mieszadłem, wykazując poprawę efektywności ekstrakcji.

W części dotyczącej końcowego etapu cyklu życia PHA pokazano, że mogą one być nie tylko odpadem do zagospodarowania, ale też surowcem do waloryzacji i odzysku mate­riału. W tym podejściu PHA o niskiej masie molowej mogą być depolimeryzowane do monomerów lub związków podstawowych (?), a następnie potencjalnie wykorzystane do repolimeryzacji, prowadzącej do uzyskania polimerów o wysokiej jakości. Tak zaprojektowany proces może służyć udoskonalaniu materiałów, takich jak stosunkowo tanie PHA otrzymane z gliceryny przemysłowej w Pracy II. W Pracy IV badano selek­tywną konwersję poli(3-hydroksymaślanu) (PHB) do kwasu krotonowego w zasado­wej cieczy jonowej [EMIM][AcO], która pełniła również funkcję katalizatora. W Pracy V analizowano hydrolizę PHB katalizowaną kwasową cieczą jonową Brønsteda [ImSO₃H][p-TsO] w układzie dwufazowym woda/metyloizobutyloketon (MIBK). Otrzymano w ten sposób kwas 3-hydroksymasłowy jako główny produkt (z kwasem krotonowym jako produktem ubocznym) przy jednoczesnym podziale fazowym pro­duktów i katalizatora. W Pracy VI przedstawiono alkoholizę PHB metanolem i eta­nolem katalizowaną kwasem p-toluenosulfonowym (p-TsOH), podkreślając elastycz­ność procesu w związku z możliwością przeprowadzania kolejnych reakcji hydrolizy w tym samym reaktorze po wymianie rozpuszczalnika i reagenta.