Multi-tissue metabolomics involves characterisation of the metabolome of several tissue types. The metabolome consists of small chemical entities of low molecular weight called metabolites, which are constantly produced and interchanged through a vast variety of biochemical reactions occurring throughout living organisms. Metabolome alterations can be attributed to genetics, environment, and diseases. We used gas chromatography timeof-flight mass spectrometry (GC TOF-MS) to characterise the metabolome of mouse organ samples: gut, kidney, liver, muscle, pancreas and plasma. Samples were obtained from wild-type mice and mice carrying a mutation in the hepatocyte nuclear factor 1b (HNF1b) gene, referred to as MODY5/RCAD (for maturity onset diabetes of the young 5/renal cysts and diabetes syndrome) mice. MODY is a class of hereditary diabetes mellitus, and MODY5 is caused by mutations in HNF1B, resulting in a wide range of manifestations, including renal diseases, kidney and genitourinary malformation, and elevation of liver enzymes. Today, MODY5 in humans is diagnosed using genetic tests, and varying referral rates and manifestations have resulted in misdiagnosis. Our main focus was therefore to increase understanding of the metabolism associated with MODY5/RCAD by studying the metabolic profiles of individual organs and plasma (Paper I) from MODY5/RCAD mutant and wildtype mice. The mouse model displayed an overall metabolic pattern consistent with the presumed outcome of the mutation in humans, making the MODY5/RCAD model suitable for studies of HNF1B-associated diseases. An understanding of metabolite origin would be beneficial for understanding the plasma profile associated with MODY5/RCAD. We used hierarchical modelling to provide an understanding of metabolite origin by detecting how metabolites from the organs contributed to the plasma metabolic profile (Paper II). Both specific and overall organ metabolite contributions to the plasma metabolic profile were studied. Further exploration of the dataset involved study of its innate variation using joint and unique multiblock analysis (JUMBA; Paper III). In addition, we explored the effects of improper sample handling for metabolomic multi-tissue data, and we studied the similarities and differences in the responses to thawing between organ tissues (Paper IV) and plasma samples (Paper V), thus identifying metabolic profiles that could indicate compromised samples. These profiles could be beneficial for large-scale collaborations that involve sample exposure to unsuitable conditions. Altogether, we have contributed to an increased understanding of the MODY5/RCAD multi-tissue metabolomic dataset and worked up protocols and strategies for how small datasets should be handled.
Metabolomik är identifieringen och statistiska utvärderingen av halten av metaboliter i en mängd prover. Metaboliter är små kemiska strukturer som produceras av alla reaktioner som pågår i organismer. Genom att tolka halten av metaboliter får man en uppfattning om organismens status, vid provtagningstillfället. Den relativa mängden av metaboliter i ett prov kan identifieras genom olika metoder. Till dessa identifieringsmetoder räknas exempelvis kärnmagnetisk resonans (eng. Nuclear Magnetic Resonance (NMR)) och masspektrometri-plattformar så som gaskromatografi (eng. Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC-MS)) och vätskekromatografi (eng. Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC-MS)). Valet av identifieringsplattform baseras på vad studien kräver.
Metabolomikstudier skiljer sig från sina föregångare. De tidigare studierna gick ut på att mäta en eller ett par variabler med hög precision. I metabolomikstudier hittas hundratals till tusentals potentiella metaboliter i varje prov. Därtill kan dess dataset innehålla en hel del brus. Metoder i klassiska, univariata, statistiken togs fram för att tillämpas på de typer av experiment där man mäter ett fåtal variabler, med hög precision. Metabolomikdata är inte av denna karaktär, utan består av många variabler (pikar/metaboliter) och färre observationer (försöksdjur/patienter). Med hjälp av multivariat dataanalys fokuserar vi på storleken hos olika variabler och deras variation för att identifiera metabolitmönster. För att finna dessa mönster används multivariata metoder som principalkomponentanalys (eng. Principal Component Analysis (PCA)) och diskriminantanalys (eng. (Orthogonal) Projections to Latent Structures Discriminant Analysis ((O)PLS-DA), där alla variabler analyseras simultant. De univariata metoderna används sedan som ett komplement till de multivariata metoderna i utvärderingen av metabolomikdata.
I denna avhandling har arbete i huvudsak kretsat kring Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY). MODY utgör en grupp ärftliga diabetestyper som orsakas av mutation i en enda gen som leder till att individen får en rubbad insulinproduktion och diabetesliknande symptom. Patienter med MODY blir ofta missdiagnostiserade med diagnosen Diabetes Typ 1 (DT1) eller Diabetes Typ 2 (DT2). De flesta MODY patienter har en underproduktion av insulin, men det finns ingen insulinresistens som vid DT2. Behandlingen med insulin eller tabletter leder då till svår hypoglykemi (sockerkänning). Vi studerade MODY5, vilken orsakas av en mutation i genen som kodar för transkriptionsfaktorn Hnf1b. MODY5 (eller RCAD (Renal Cysts And Diabetes syndrome)) misstänks då patienten har en DT1 eller DT2 diagnos samt njurpåverkan. Idag diagnosticeras MODY5 genom genetiska tester, dock är dessa dyra och diagnosen relativt okänd bland kliniker. Genom att öka förståelsen för sjukdomen så finns förutsättningar för att förbättra både behandling och diagnostisering.
Proverna som analyserades i denna avhandling kom från möss av vildtyp samt möss med en mutation som gav ett MODY5-liknande tillstånd. Alla möss föddes upp i Paris, Frankrike (Cereghini et al.). Då mössen var åtta månader placerades de i varsin metabol bur och övervakades noggrant i fem dagar. Såväl mat- och vattenintag som mängden urin- och avförings samt blodsocker och kroppsvikt mättes dagligen och utgör metadata. På den femte dagen offrades mössen och deras lever, muskler, njurar, bukspottkörtel och magtarmsystem samt blodplasma placerades i -80 °C frysar. Dessa skickades i två försändelser till Umeå för analys, där proverna i den ena nådde Umeå tinade.
I Paper I fastställde vi de metabola profilerna för sjukdomstillståndet (MODY5/RCAD), i var och en av de undersökta organen och plasma. MODY5/RCAD mössen uppvisade tecken på nedsatt njurfunktion och förändrad fettsyra och lipidmetabolism i organvävnaderna. Vi fann även att tarmarna påverkats mindre av mutationen, jämfört med hur det såg ut för de övriga organen och plasma. Detta kan ha att göra med att Hnf1b är viktig vid bildandet av bukspottkörtel, lever och njurar, i det unga musembryot. Varför musklerna skulle vara mer påverkade än tarmen krävs det vidare studier för att fastställa.
I Paper II fokuserade vi på hur de olika organen bidrar till metaboliterna i blodplasma och undersökte vilka metaboliter som varje organ bidrar med till plasma. Målet med denna studie var att undersöka hur hierarkisk modellering kan användas för att identifiera detta bidrag. Vi visade att alla undersökta organ bidrog till metabolitnivåerna hos blodplasma, men att det var mag-tarmsystemet som hade största bidraget. Den hierarkiska modellen kunde även vis på de organspecifika metabolitbidraget till blodplasma. Då de identifierade flödena överensstämde med vad vi kunde förvänta oss, baserat på rådande forskning, skulle denna strategi kunna användas för att studera flödet av okända metaboliter.
Paper III behandlar hur man kan utföra dataintegrering av ett litet dataset. Genom att integrerar data från olika block (i detta fall representerade varje vävnadstyp ett block) kunde vi identifiera gemensamma mönster, gemensam variation. Den integrationsmetod vi använde var JUMBA (Joint and Unique MultiBlock Analysis) som kan identifiera både global variation (som återfinns i alla block), lokal variation (som återfinns i några av blocken) och unik variation (endast återfunnen i ett block). JUMBA extraherade två globala komponenter som vi kunde tolka som en annorlunda aminosyraprofil och fettsyraprofil hos en av mössen, samt att vissa skillnader berodde på mössens storlek. JUMBA fann även upp de två genotyperna, i alla block utom mag-tarmsystemet (alltså i en lokal komponent) vilket överensstämmer med fynden i Paper I. I en andra lokal komponent fann JUMBA hur de olika mössen befann sig i tre olika stadier av energimetabolism. Detta indikerar att JUMBA lämpar sig för att få fram information, även i fall med få prover.
I Paper IV undersökte vi hur de olika vävnadstyperna reagerat på upptining. De metabola profilerna hos prover som tinat under transporten jämfördes mot sådana som behandlats enligt standardprotokoll (SOP). Genom att identifiera metaboliter som är specifika för felbehandlade, tinade prover fann vi ett metabolitmönster som ska ses som alarmerande. De olika organproverna reagerade likartat på att ha tinat under transporten, med proteindegradering och cellsönderfall. Om denna typ av mönster observeras måste provens kvalité granskas. I en andra studie av tinade prover (Paper V) jämförde vi dessa resultat med de tinade plasmaproven och fann att organproverna var känsligare för upptining. Dock uppstod förändringar även i plasmaproverna.
Sammanfattningsvis har denna avhandling bidragit till en ökad förståelse för detta multivävnads dataset och upparbetat protokoll för hur små dataset (där små dataset avser sådana med färre än femton observationer per grupp) ska hanteras. Vi har bedömt hur väl MODY5/RCAD musmodellen skulle fungera som modell och dess potential i pre-kliniska studier av HNF1 B-associerade sjukdomar. Vi har studerat hur olika organ bidrar till de metabolitnivåer som återfinns i blodplasma. Vikten av att prover hanteras korrekt och på samma sätt samt vikten av randomisering har också diskuterats. Dessutom har vi diskuterat olika multivariata dataanalysmetoder och betydelsen av de metabola variationer vi identifierat.
Mycket har hänt inom metabolomik under mina år som doktorand, det är fortfarande ett relativt ungt fält men med mycket tydligare riktlinjer. Stora insatser har lagts på att standardisera namngivningen av metaboliter och hanteringen av prover. Mängden metaboliter som identifieras har ökat enormt och så även precisionen med vilken de mäts. Väl upparbetade standardprotokoll finns och kunskapen om olika metaboliter ökar för var dag som går. Fältet som sådant visar enorm potential vad gäller diagnostisering och monitorering av sjukdomar samt identifiering av nya behandlingsmål. Jag ser framemot att följa dess utveckling vidare.
Umeå: Umeå universitet , 2020. , p. 63