Umeå universitets logga

Proteins are central agents for all cellular processes of life. They confer shape or enable motility, act as defence or a means of aggression, and catalyse a plethora of chemical reactions. A protein’s function is typically determined by its three-dimensional structure and, indeed, many human diseases arise when proteins misfold or denature prematurely. Yet life has continuously evolved since its inception, implying that there are underlying principles governing which changes are viable and which are not. By determining the atomic structure of proteins, we can follow these evolutionary trajectories and unveil how they influence biological function. With cutting-edge scientific methods, such insights can, in turn, be used to guide the design of new drugs, or, due to recent advances in engineering, the synthetic design of entirely novel proteins. 

In this thesis, I aim to contribute to the fundamental understanding of structural biology by exploring aspects of both natural and directed protein evolution. I used state-of-the-art cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) to characterize protein structures, enabling detailed analyses of how evolution navigates structural constraints to repurpose protein folds and optimize molecular interactions. 

In the first project of this thesis, I investigate the emergence of novel ribosomal proteins in Microsporidia. By analysing high-resolution structural models of their ribosomes, I observed a progressive reduction of ribosomal RNA, loss of expansion segments, and truncation of ribosomal proteins. To maintain ribosomal integrity, microsporidia acquired new proteins that compensate for the loss of stabilizing interactions. I discovered that these proteins were in essence ‘evolved fold-switchers’: homologs that adopted highly dissimilar structures, with inverted termini, despite occupying the same ribosomal niche. Thus, these findings represent a rare example where a proteins’ function and cellular environment are more conserved than its fold. 

The second project shifts the focus towards directed evolution. Here, an affinity protein, CaRAEGFR, was engineered to recognize the cancer marker epidermal growth factor receptor (EGFR) via a mechanism calibrated to high calcium concentrations typically found in the bloodstream. As a result, CaRAEGFR bind its target with high affinity whilst in circulation but loses this affinity after being trafficked into cells via endocytosis. This conditionally regulated mechanism greatly improved CaRAEGFRs potential to act as a targeting unit for protein-drug conjugates, and we demonstrated potent cytotoxicity in EGFR-expressing cancer cells when CaRAEGFR was coupled to a drug. Although the complex of CaRAEGFR and EGFR corresponds to a size of only ~80 kDa, I could confirm their interaction using single-particle analysis (SPA) cryo-EM. 

In the third project, I expand on these findings by providing a more detailed structural characterization of the CaRAEGFR:EGFR complex using cryo-EM. I observed that CaRAEGFR engaged with EGFR via a hydrophobic cleft in domain III and compared this mode of recognition to other known EGFR-binding proteins. Complementary NMR experiments were used to probe calcium-dependent structural changes, allowing us to propose an allosteric mechanism in which environmental calcium concentrations modulate this interaction. 

The fourth project returns to natural protein evolution. Here, I investigated the biochemical properties of BmdE, a nuclease involved in interspecies biofilm dispersion. Using cryo-EM, I solved the structure of its nuclease core, revealing a novel, extended phosphodiesterase domain comprising an a/b sandwich motif. Notably, the cryo-EM data contained additional densities suggesting an intermediate reaction state ‘trapped’ after DNA cleavage. The structural information was then used to establish an evolutionary context, revealing that BmdE-like nucleases represent a kingdom-spanning protein family rather than a newly evolved, species-specific mechanism. 

In summary, this thesis explores diverse structure-function relationships across evolutionary scales, ranging from the de novo birth and subsequent fold switching of ribosomal proteins to a rationally engineered, conditionally regulated affinity protein for cancer treatment. Collectively, this work contributes new insights into the adaptability of protein architectures that may guide future efforts in structure-based drug design, protein engineering and biofilm control. 

Proteiner är centrala aktörer i alla cellers livsprocesser. De ger form eller möjliggör motilitet, fungerar som försvar eller som ett medel för angrepp och katalyserar en mängd reaktioner, som exempelvis energiomvandling. Ett proteins funktion bestäms vanligtvis av dess tredimensionella struktur, och många sjukdomar hos människan uppstår faktiskt när proteiner veckas fel, denatureras eller muterar. Ändå har livet kontinuerligt utvecklats sedan dess uppkomst, vilket antyder att det finns underliggande principer som styr vilka förändringar som är livskraftiga och vilka som inte är det. Genom att bestämma proteiners atomstruktur kan vi följa dessa evolutionära utvecklingsbanor och förklara hur de påverkar dess molekylära funktion. Med hjälp av banbrytande vetenskapliga metoder kan sådana insikter i sin tur användas för att vägleda utformningen av nya läkemedel, eller, i allt högre grad, den syntetiska designen av helt nya proteiner genom ingenjörskonst. 

Denna avhandling syftar till att öka förståelsen för de grundläggande principerna inom strukturbiologin genom att utforska aspekter av både naturlig och styrd proteinevolution. Avancerad kryo-EM har använts för att strukturellt karakterisera två exempel på ovanligt små proteiner, vilket möjliggör detaljerade analyser av hur evolutionen hanterar strukturella begränsningar för att omforma proteinstrukturer och optimera molekylära interaktioner. 

Det första projektet i denna avhandling undersöker uppkomsten av nya ribosomala proteiner hos mikrosporidier. Genom att analysera högupplösta strukturmodeller av deras ribosomer kunde vi observera en gradvis reducering av rRNA, förlust av expansionssegment samt en förkortning av ribosomala proteiner. För att upprätthålla ribosomernas integritet förvärvade mikrosporidierna nya proteiner som kompensation för förlusten av stabiliserande interaktioner. Vi upptäckte att dessa proteiner i huvudsak var ”evolutionära veckningsväxlare” – homologer som antog väldigt annorlunda strukturer med inverterade terminaler, trots att de upptog samma ribosomala nisch. Dessa fynd representerar ett sällsynt exempel där ett proteins funktion och cellulära miljö är mer bevarade än dess veckning. 

Det andra projektet fokuserar på riktad evolution. Det beskriver utvecklingen av ett affinitetsprotein, CaRAEGFR, som utvecklats för att binda cancermarkören EGFR via en kalciumskoncentrationsberoende mekanism. Genom att göra proteinets aktivitet kalciumberoende kunde den skräddarsys för att binda sitt mål medan den cirkulerar, men också snabbt dissocieras efter internalisering. Detta förbättrade dess potential som ett mål för protein-läkemedelskonjugat avsevärt; vi visade också hög cytotoxicitet i EGFR-uttryckande cancerceller när bindaren kopplades till ett läkemedel. Även om komplexet av bindare och receptor endast motsvarar ~80 kDa, kunde vi initialt bekräfta deras interaktion med hjälp av kryo-elektronmikroskopi. 

Det tredje projektet bygger vidare på dessa resultat genom att tillhandahålla en mer detaljerad strukturell karakterisering av bindningsmolekylen i komplex med sin receptor. Med hjälp av kryo-EM observerade vi att CaRAEGFR binder till EGFR via en hydrofobisk hotspot i domän III och jämförde detta bindningssätt med andra kända EGFR-bindande proteiner. Kompletterande NMR-experiment användes för att undersöka kalciumberoende strukturella förändringar, vilket gjorde det möjligt för oss att föreslå en allosterisk mekanism genom vilken kalciumkoncentrationer i omgivningen modulerar denna interaktion. 

Det fjärde projektet återvänder till den naturliga evolutionen. Här undersökte jag de biokemiska egenskaperna hos ett nukleas som är inblandat i nedbrytning av biofilm. Med hjälp av kryo-EM löste vi strukturen hos nukleasets-kärna, vilket avslöjade en ny, utsträckt fosfodiesterasdomän bestående av ett α/β-sandwichmotiv som inte tidigare har associerats med extracellulär DNA nukleaser. Noterbart är att kryo-EM data innehöll ytterligare densiteter som tyder på en reaktionsmellanprodukt som ”fastnat” under DNA-klyvningen. Strukturinformationen användes sedan för att fastställa ett evolutionärt sammanhang, vilket avslöjade en proteinfamilj som spänner över flera riken snarare än en unikt utvecklad mekanism. 

Sammanfattningsvis undersöker denna avhandling olika struktur-funktionssamband på olika evolutionära nivåer, från ribosomproteiners uppkomst från grunden och efterföljande omformning till rationell design som möjliggör kontrollerad reglering. Sammantaget bidrar detta arbete med nya insikter om proteinarkitekturens anpassningsförmåga, vilket kan ligga till grund för framtida insatser inom strukturbaserad läkemedelsdesign, proteinmodifiering och bekämpning av biofilmer.